陳逍遙 趙瓊瑜 彭振輝 宋偉

摘要：以烏鱉肌肉為原料，采用“脫脂—酶解—酸解”三步法提取烏鱉黑色素，研究脫除蛋白、分離純化烏鱉黑色素的工藝條件，通過(guò)掃描電鏡對(duì)烏鱉黑色素純化效果進(jìn)行觀察，并用傅里葉紅外光譜儀對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。最佳脫脂工藝為：乙醇回流脫脂8次，料液比1 g ∶ 60 mL，脫脂率為98.99%。脫脂后用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，其最佳工藝為：酶底比為1 mg ∶ 2 g、酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間5 h、料液比1 g ∶ 25 mL、酶解pH值5.0，蛋白質(zhì)脫除率最高;酸純化的最優(yōu)工藝為：鹽酸濃度6 mol/L、料液比1 g ∶ 15 mL、時(shí)間4 h、溫度100 ℃，蛋白質(zhì)脫除率最高。在“脫脂—酶解—酸解”條件下總雜質(zhì)脫除率高達(dá)98.91%。通過(guò)掃描電鏡可見(jiàn)純化黑色素為均勻的橢圓形顆粒，顆粒表面光滑清晰，同時(shí)結(jié)合傅里葉紅外光譜具有非常典型的吲哚結(jié)構(gòu)，提取的烏鱉黑色素純度高、結(jié)構(gòu)完整，可用于降解和結(jié)構(gòu)研究。

關(guān)鍵詞：烏鱉;黑色素;提取工藝;脫脂工藝;酶解工藝;酸純化工藝;結(jié)構(gòu)性狀

中圖分類(lèi)號(hào)： TS254.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0182-07

清溪烏鱉（Pelodiscus sinensis，簡(jiǎn)稱(chēng)烏鱉）是從中華鱉的體色變異個(gè)體經(jīng)過(guò)擴(kuò)繁得到的新品種[1]，是浙江省特有地方品種，其典型形態(tài)特征是全身體色烏黑，富含黑色素，具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值[2]。黑色素是目前所知唯一能保護(hù)生物體免受輻射傷害的天然內(nèi)源性生物聚合體[3]，具有很強(qiáng)的生理活性，能夠有效地消除自由基[4-5]，對(duì)人體具有提高機(jī)體免疫力[6]、防止衰老[7-8]、抑制病毒[9]等功能，因此黑色素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和保健品等領(lǐng)域。

目前，天然黑色素的開(kāi)發(fā)研究主要集中在植物和真菌類(lèi)材料，包括黑米[10]、山杏[11]、黑木耳[12]、靈芝等[13]，主要采用超聲波輔助提取法。動(dòng)物中黑色素與蛋白質(zhì)緊密相連、不易分離，要獲得比較純凈的黑色素，就必須盡可能去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。因此，動(dòng)物來(lái)源的黑色素研究只局限在烏骨雞等少數(shù)動(dòng)物材料中。但國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要從形態(tài)特征[1]、養(yǎng)殖性能[14]、營(yíng)養(yǎng)成分[15]、同工酶[16]、細(xì)胞水平和DNA 分子水平[17]等方面對(duì)烏鱉種質(zhì)資源進(jìn)行研究。有關(guān)烏鱉中黑色素的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以烏鱉為研究對(duì)象，系統(tǒng)建立烏鱉的黑色素提取工藝，探究烏鱉的黑色素結(jié)構(gòu)性狀，有利于烏鱉的高附加值綜合利用，對(duì)加快黑色食品的發(fā)展具有十分重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成體烏鱉，體質(zhì)量約為500 g，購(gòu)于浙江清溪鱉業(yè)股份有限公司。

主要儀器有ME204型電子天平，購(gòu)自梅特勒-托利多公司;DS-1高速組織搗碎機(jī)，購(gòu)自上海標(biāo)本模型廠;Alphal-4LSCplus冷凍干燥機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Christ公司;5810大容量低溫高速臺(tái)式離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;DHG9246A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Cary100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自安捷倫科技有限公司;S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，購(gòu)自日本日立公司。

主要試劑有黑色素標(biāo)準(zhǔn)品（M2649），購(gòu)自Sigma公司;木瓜蛋白酶，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;無(wú)水乙醚、石油醚、無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等，均為國(guó)藥分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 烏鱉肌肉主要成分的測(cè)定 烏鱉肌肉中水分含量測(cè)定參考GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中105 ℃干燥恒重法;粗蛋白含量測(cè)定參考GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》自動(dòng)凱氏定氮儀法;粗脂肪含量測(cè)定參考GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》索氏抽提法;灰分含量測(cè)定參考GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》中550 ℃馬弗爐干法灰化法。

1.2.2 烏鱉肌肉預(yù)處理 在實(shí)驗(yàn)室活體宰殺后剝離肌肉，在高速組織勻漿機(jī)中打碎成肉糜，于冷凍干燥機(jī)中凍干，-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 脫脂工藝的優(yōu)化 （1）單因素試驗(yàn)。精確稱(chēng)取樣品置于索氏提取器中，在不同溶劑（無(wú)水乙醚、石油醚、無(wú)水乙醇）、回流次數(shù)（4、5、6、7、8、9）、料液比（1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 60 mL、1 g ∶ 75 mL、1 g ∶ 100 mL、1 g ∶ 150 mL）等因素下測(cè)定脫脂效果。脫脂反應(yīng)結(jié)束后，濾液真空濃縮，得烏鱉油脂，濾渣置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒質(zhì)量，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算脫脂率，評(píng)價(jià)各條件對(duì)烏鱉肌肉脫脂效果的影響。

烏鱉油脂脫除率=烏鱉油脂質(zhì)量（g）烏鱉粗脂肪含量（g）×100%。

（2）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過(guò)單因素試驗(yàn)的優(yōu)化，以無(wú)水乙醇為脫脂浸提試劑，選擇料液比（A）、回流次數(shù)（B）作為試驗(yàn)因子，采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)L9（32）正交試驗(yàn)條件，以脫脂率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳脫脂工藝。

1.2.4 ?酶解制備黑色素的工藝優(yōu)化 （1）單因素試驗(yàn)。精確稱(chēng)取一定量的脫脂樣品，將其置于蛋白酶反應(yīng)液中，在不同蛋白酶[木瓜蛋白酶（55 ℃，pH值5.5）、胃蛋白酶（37 ℃，pH值2.5）、胰蛋白酶（37 ℃，pH值8.0）]、料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL）、pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、溫度（50、55、60、65、70、75 ℃）、酶底比[1 mg ∶ 4 g、1.5 mg ∶ 4 g、2 mg ∶ 4 g、3 mg ∶ 4 g、4 mg ∶ 4 g（質(zhì)量比，下同）]、酶解時(shí)間（3、4、5、6、7 h）單因素下測(cè)定蛋白脫除效果。將樣品置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒質(zhì)量，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算蛋白質(zhì)脫除率，評(píng)價(jià)各條件對(duì)烏鱉肌肉脫蛋白效果的影響。

蛋白質(zhì)脫除率=烏鱉干肉（g）-酶解殘?jiān)|(zhì)量（g）烏鱉干肉質(zhì)量（g）×100%。

（2）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以單因素試驗(yàn)篩選的酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）、料液比（E）和酶解pH值（F）作為試驗(yàn)因子，采用L9（34）正交試驗(yàn)條件，以蛋白質(zhì)脫除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳工藝。

1.2.5 酸法純化黑色素的工藝優(yōu)化 （1）單因素試驗(yàn)。精確稱(chēng)取一定量的黑色素粗品，將其置于鹽酸反應(yīng)液中，在不同時(shí)間（1、6、12、24、48 h）、溫度（25、60、70、80、90、100 ℃）、鹽酸濃度（1、3、6、9、12 mol/L）、料液比（1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 100 mL、1 g ∶ 200 mL）單因素下測(cè)定黑色素純化效果。酸純化反應(yīng)結(jié)束后，將樣品置于干燥箱中以60 ℃干燥至恒質(zhì)量，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算雜質(zhì)脫除率，評(píng)價(jià)各條件對(duì)烏鱉肌肉黑色素純化效果的影響。

雜質(zhì)脫除率=酶解殘?jiān)|(zhì)量（g）-酸化殘?jiān)|(zhì)量（g）酶解殘?jiān)|(zhì)量（g）×100%。

（2）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選擇鹽酸濃度（G）、時(shí)間（H）、溫度（I）和溫度（J）作為試驗(yàn)因子，采用 L9（34） 正交試驗(yàn)條件，以雜質(zhì)脫除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性分析，篩選最佳脫除工藝。

1.2.6 烏鱉黑色素的結(jié)構(gòu)性狀 （1）電鏡掃描。將樣品均勻散布在導(dǎo)電膠上，置于金屬載物臺(tái)，用常規(guī)真空噴鍍法噴金90 s，放置于掃描電鏡下觀察，選取有代表性的視野進(jìn)行顯微拍攝。（2）傅里葉紅外掃描。稱(chēng)取1 mg烏鱉黑色素樣品、1 mg烏骨雞黑色素樣品和1 mg黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，將樣品分別與0.1 g溴化鉀混合，在瑪瑙研缽中研成細(xì)粉，混合均勻，用紅外壓片機(jī)壓片。測(cè)定樣品在400～4 000 cm-1 范圍內(nèi)的紅外吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏鱉肌肉基本成分分析

烏鱉肌肉中測(cè)定的水分含量為77.76%，干物質(zhì)含量為22.24%。烏鱉肌肉干物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分如表1所示，粗蛋白的含量高達(dá)77.56%，脂肪比例為16.85%，灰分比例為5.59%?？梢?jiàn)，烏鱉肌肉中主要成分為蛋白質(zhì)，其含有的脂肪含量也較高。因此，要對(duì)烏鱉肌肉組織進(jìn)行有效的脫脂和脫蛋白工藝。

2.2 脫脂工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 烏鱉肉脫脂工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn) 在料液比為1 g ∶ 75 mL、回流溫度為90 ℃、回流8次的初始條件下進(jìn)行脫脂單因素試驗(yàn)，研究溶劑種類(lèi)、料液比、回流次數(shù)對(duì)烏鱉肉脫脂率的影響，結(jié)果如圖 1 所示，烏鱉肌肉在無(wú)水乙醇中回流8次、料液比為1 g ∶ 60 mL時(shí)的脫脂率最高。

2.2.2 烏鱉肉脫脂工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn) 烏鱉肌肉乙醇脫脂的正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析如表2、表3所示。根據(jù)極差R值大小，2個(gè)因素的主次順序?yàn)锽（回流次數(shù)）>A（料液比）。結(jié)合k值可知烏鱉肌肉脫脂率最高（98.99%）的條件是：料液比 1 g ∶ 60 mL、回流次數(shù) 8次。在9個(gè)試驗(yàn)中8號(hào)試驗(yàn)組為這一組合，因此A3B2組合為最優(yōu)組合。根據(jù)方差分析結(jié)果可知，各因素在正交試驗(yàn)所選水平下對(duì)烏鱉肌肉脫脂率都有影響，但回流次數(shù)和料液比對(duì)其影響不顯著（P>0.05） 。

2.3 酶法制備黑色素工藝優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 烏鱉肉蛋白質(zhì)脫除工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn) 在酶底比1 mg ∶ 4 g、料液比1 g ∶ 10 mL、酶解時(shí)間 4 h 的初始條件下進(jìn)行黑色素酶解單因素試驗(yàn)。蛋白酶種類(lèi)、料液比、酶解pH值、酶解溫度、酶底比、酶解時(shí)間因素對(duì)烏鱉肌肉蛋白脫除效果的影響如圖2所示，木瓜蛋白酶在料液比為1 g ∶ 25 mL、pH值為5.5、溫度為60 ℃、酶底比為2 mg ∶ 4 g、酶解時(shí)間為6 h條件下可較大限度去除蛋白質(zhì)。

2.3.2 蛋白質(zhì)脫除工藝優(yōu)化正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇木瓜蛋白酶和酶底比為2 mg ∶ 4 g為固定條件，以酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）、料液比（E）、酶解pH值（F）為試驗(yàn)因子設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，所得結(jié)果見(jiàn)表4。9組試驗(yàn)結(jié)果中6號(hào)試驗(yàn)蛋白質(zhì)脫除率最高，高達(dá)95.90%，相應(yīng)的水平組合為C2D3E2F1。根據(jù)數(shù)據(jù)的極差R值分析結(jié)果，主次因素依次為E（料液比）>C（酶解溫度）>F（酶解pH）>D（酶解時(shí)間）。結(jié)合k值進(jìn)行分析可知，C2D1E2F1的組合較優(yōu)異，該組合條件為：酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間5 h、料液比1 g ∶ 25 mL、酶解pH值5.0。在此條件下，蛋白脫除率為95.98%。因此C2D1E2F1為最優(yōu)組合。方差分析結(jié)果（表5）表明，各因素在正交試驗(yàn)所選水平下對(duì)烏鱉肉的蛋白脫除率都有影響，酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比和pH值對(duì)其影響顯著（P<0.05）。

2.4 ?酸法純化工藝優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 雜質(zhì)脫除工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn) 酸化時(shí)間（G）、 酸化溫度（H）、 鹽酸濃度（I）和料液比（J）對(duì)烏鱉黑色素粗品雜質(zhì)脫除率的影響如圖3所示，9 mol/L HCl溶液、溫度100 ℃、料液比1 g ∶ 20 mL條件下磁力攪拌24 h，烏鱉黑色素的雜質(zhì)脫除率最大。但鹽酸濃度為9 mol/L及以上時(shí)，易爆塞、溶液濺出，危險(xiǎn)性大，因此選擇6 mol/L。

2.4.2 雜質(zhì)脫除工藝優(yōu)化正交試驗(yàn) 雜質(zhì)脫除工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果如表6所示，方差分析見(jiàn)表7，9組中以2號(hào)蛋白質(zhì)脫除率最高（71.52%），相應(yīng)的組合為G2H1I2J3，即鹽酸濃度為6 mol/L、料液比為1 g ∶ 15 mL、 時(shí)間為4 h、溫度為100 ℃。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)極差R值分析可知，影響脫除率的的主次因素依次為H（料液比）>J（酸化溫度）>I（酸化時(shí)間）>G（HCl濃度）。結(jié)合k值分析結(jié)果可知，G3H1I2J3的組合更佳，經(jīng)驗(yàn)證，該組合的蛋白質(zhì)脫除率為71.84%，與G2H1I2J3的脫除率差異較小，同時(shí)考慮到鹽酸濃度越高，其腐蝕性越強(qiáng)，操作時(shí)對(duì)人體的危險(xiǎn)系數(shù)大，因此最佳組合選擇G2H1I2J3。根據(jù)方差分析結(jié)果（表7）可知，在正交試驗(yàn)所選水平下，各因素對(duì)黑色素粗品雜質(zhì)脫除率都有顯著影響 （P<0.05）。

[7]Yao-Ching H，Vasyl M S，Svetlana Y M，et al. Antioxidant activity of melanins derived from tea：comparison between different oxidative states[J]. Food Chemistry，2002，78（2）：233-240.

[8]Rageh M M，El-Gebaly R H. Melanin nanoparticles：antioxidant activities and effects on γ-ray-induced DNA damage in the mouse[J]. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2018，828（2）：15-22.

[9]El-Naggar N A，El-Ewasy S M.Bioproduction，characterization，anticancer and antioxidant activities of extracellular melanin pigment produced by newly isolated microbial cell factories Streptomyces glaucescens NEAE-H[J]. Scientific Reports，2017，7（2）：1-19.

[10]張吉祥，趙文靜，白曉杰，等. 正交試驗(yàn)法優(yōu)化黑米黑色素的超聲輔助提取工藝[J]. 食品科學(xué)，2010，31（4）：39-41.

[11]李紅姣，李巨秀，趙 忠. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取山杏種皮黑色素工藝及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué)，2016，37（18）：26-33.

[12]張艷榮，王慶慶，劉 通，等. 木耳黑色素堿法提取工藝優(yōu)化及表征[J]. 食品科學(xué)，2016，37（12）：27-32.

[13]張小林，陳博文，孫曉瑞，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助靈芝黑色素提取工藝[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2018，32（3）：532-538.

[14]薛輝利，何中央，張海琪，等. 清溪烏鱉養(yǎng)殖性能的初步研究[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，2009（6）：42-43.

[15]張海琪，何中央，徐曉林，等. 中華烏鱉的營(yíng)養(yǎng)成分研究[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，2008，7（6）：76.

[16]楊 弘，夏德全，吳婷婷，等. 中華鱉同工酶研究[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，1997，4（4）：55-59.

[17]張海琪，何中央，邵建忠. 中華鱉培育新品種群體遺傳多樣性的比較研究[J]. 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2011，15（1）：39-46.

[18]Liu Y，Simon J D. Isolation and biophysical studies of natural eumelanins：applications of imaging technologies and ultrafast spectroscopy[J]. Pigment Cell Research，2003，16（6）：606-618.

[19]蔡華珍，張 麗. 蛋白酶法提取烏骨雞黑色素的研究[J]. 肉類(lèi)工業(yè)，2005，8（12）：24-26.

[20]劉永忠，何滿(mǎn)蓮，吳 莉. 酸提法提取烏骨雞黑色素的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（31）：15256，15258.

[21]Tu Y G，Xie M Y，Sun Y Z，et al. Structural characterization of melanin from black-bone silky fowl （Gallus gallus domesticus Brisson）[J]. Pigment Cell & Melanoma Research，2009，22（1）：134-136.

[22]張恒業(yè)，李 欣，岳曉禹.烏骨雞黑色素的分步酶解法制備及其性能研究[J]. 食品科學(xué)，2011，32（24）：55-59.

[23]黃宇玫，田穎剛，朱 勝.烏骨雞黑色素三步法提取及結(jié)構(gòu)性狀研究[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（1）：249-253.

[24]王高富，蔣 婧，付 琳，等. 酉州烏羊皮膚黑色素含量和結(jié)構(gòu)分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)（下半月），2019，5（10）：35-38.

[25]張蓮姬，崔泰花. 泥鰍魚(yú)皮黑色素提取工藝的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，3（5）：263-265.

[26]楊 慧，陳德經(jīng)，夏冬輝，等. 大鯢皮膚色素提取工藝及抗氧化研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2019，31（5）：887-894.

[27]王建波，劉恒旭，李鑫佳，等. 海參黑色素的提取及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究[J]. 食品科技，2019，44（4）：255-260.

[28]于文超，何 成，武長(zhǎng)路，等. 長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）貝殼與外套膜中黑色素的提取和鑒定[J]. 海洋與湖沼，2015，46（4）：909-914.莊 苑，馮艷，趙佳倫，吳芳芳，孔德政 . 不同保色劑對(duì)荷花壓花顏色的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（24）：189-193.