廖娟 王鋼 喻世剛 梁梓

摘要：為探索沐川烏骨雞腸道微生物多樣性，采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)10羽沐川烏骨雞的空腸內(nèi)容物樣本中微生物的16S rDNA-V4變異區(qū)進(jìn)行測(cè)序，利用UPARSE等軟件分析和統(tǒng)計(jì)樣品中的操作分類單元（OTUs）數(shù)量，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，揭示樣品的物種構(gòu)成。結(jié)果表明，共獲得667 466條tags，在97%相似水平上進(jìn)行OTU分類，被歸類于3 154個(gè)OTUs，且由稀釋曲線可知此次測(cè)序結(jié)果較全面地覆蓋了沐川烏骨黑雞空腸微生物群落。門水平上，占優(yōu)勢(shì)的門主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），但這3種優(yōu)勢(shì)菌門在不同樣品中所占比例均有所差異。在屬水平上，在10個(gè)樣品中所占比例均大于1%的菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）和Romboutsia菌屬。

關(guān)鍵詞：沐川烏骨黑雞;Illumina MiSeq測(cè)序;空腸;微生物;多樣性

中圖分類號(hào)： S831;S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0178-04

在動(dòng)物的身體部位中，胃腸道中定殖著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物，這類復(fù)雜的微生物群落被稱為腸道微生物[1]。腸道微生物菌群在宿主營(yíng)養(yǎng)、發(fā)育、免疫及代謝等過(guò)程中起著重要作用[2-3]。近年來(lái)，腸道微生物多樣性成為很多學(xué)者的研究熱點(diǎn)，腸道微生物多樣性的研究方法較多，早期主要采用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法[4]，但是腸道中有很多厭氧型細(xì)菌，傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法無(wú)法分離培養(yǎng)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，末端限制性片段長(zhǎng)度多樣性分析、變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳等技術(shù)廣泛運(yùn)用于腸道微生物的分析中，這些方法雖能檢測(cè)一些厭氧型微生物，但這些研究技術(shù)獲得的信息覆蓋量仍不能充分反映出腸道微生物的多樣性。Illumina MiSeq技術(shù)因其方便、快速、準(zhǔn)確率高和信息覆蓋量大等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于兔[5]、人[6]、蜜蜂[7]等的腸道微生物研究中。林奕岑等[8]、徐帥等[9]采用Illumina MiSeq技術(shù)分別對(duì)普通雞的盲腸和回腸的微生物多樣性進(jìn)行分析，但對(duì)沐川烏骨黑雞腸道微生物分析尚未見(jiàn)報(bào)道。沐川烏骨黑雞是四川省樂(lè)山市的優(yōu)良地方品種資源，在沐川縣具有悠久的種源歷史，屬藥肉兼用型品種，因其全身烏黑而得名[10]，其生產(chǎn)性能及健康程度與復(fù)雜的腸道微生物組成密切相關(guān)。本研究利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)分析了沐川烏骨黑雞空腸微生物多樣性，旨在為相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)采用1日齡健康的沐川烏骨黑母雞，購(gòu)于四川省樂(lè)山市沐川縣黑鳳凰烏骨雞業(yè)有限公司，采用相同的飼養(yǎng)和管理方式。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 于30日齡時(shí)，隨機(jī)選取10羽健康個(gè)體，無(wú)菌操作采集每羽沐川烏骨黑雞的空腸內(nèi)容物，依次編號(hào)K1～K10，并快速置于液氮罐中，帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 總DNA提取 采用SDS方法提取空腸內(nèi)容物樣本基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，采用無(wú)菌水稀釋至1 ng/μL。

1.2.3 基因文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序 以稀釋后的樣品基因組 DNA 為模板，使用16S rRNA-V4區(qū)特異性引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)后，切下目標(biāo)條帶，用Thermo Scientific 公司GeneJET膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

使用建庫(kù)試劑盒（Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒）進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)定量、檢測(cè)合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。測(cè)序工作在諾禾致源生物信息有限公司完成。

1.3 生物信息學(xué)分析

測(cè)序完成后，原始數(shù)據(jù)使用Cutadapt對(duì)低質(zhì)量部分進(jìn)行剪切[11]，再根據(jù)Barcode從得到的reads中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列得到的原始數(shù)據(jù)（raw reads）后，利用UCHIME Algorithm 軟件去除嵌合序列[12]，得到有效數(shù)據(jù)（clean reads）。利用Uparse軟件對(duì)所有樣品的全部clean reads按97%的相似性進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，簡(jiǎn)稱OTU）聚類。并對(duì)用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析[13-14]。采用Qiime軟件計(jì)算每個(gè)樣品的Alpha多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣品序列及OTUs信息

本試驗(yàn)基于Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)10羽沐川烏骨黑雞的空腸內(nèi)容物菌群V4區(qū)進(jìn)行了測(cè)序，一共獲得667 466條tags，在97%的相似水平上進(jìn)行OTU分類，被歸類于3 154個(gè)OTUs。其中，tags數(shù)量最高的是樣品K3，為86 261條;tags數(shù)量最低的是樣品K9，為47 679條。

2.2 Alpha多樣性分析

采用Alpha多樣性指數(shù)分析樣品內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性。從樣品稀釋曲線（圖1）可知，隨著測(cè)試深度的不斷加深，稀釋曲線逐漸趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，10個(gè)樣本的覆蓋率（good's coverage）均達(dá)到了99.0%以上，表明更多的數(shù)據(jù)量?jī)H會(huì)產(chǎn)生少量新OTUs，16S rRNA基因測(cè)序深度足以反映樣品的微生物多樣性。

采用Chao1、ACE、Shannon、Simpson等指數(shù)表示，樣品中微生物群落的Alpha多樣性。Chao1或ACE指數(shù)越大，表明樣品群落豐富度越高;Shannon指數(shù)越高，表明群落物種多樣性越高;Simpson指數(shù)越高，表示其群落均勻度越高。由表1可知，樣品K2物種豐富度相對(duì)較高，樣品K4物種多樣性相對(duì)較高。

3.3 物種注釋

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)樣品在門水平上最大豐度排名前10的物種和在屬水平上最大豐度排名前30的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣品在門和屬分類水平上相對(duì)豐度較高的物種及其比例。由圖2和圖3可知，10個(gè)樣品共獲得45個(gè)菌門，559個(gè)菌屬。

門水平上，占優(yōu)勢(shì)的門主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），這3個(gè)菌門總比例在每個(gè)樣品中均在84%以上，但這3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門在不同樣品中所占比例有所差異。厚壁菌門在10個(gè)樣品中所占比例均最高，均高于35%，其中K7樣品中高達(dá)79%。

在屬水平上，共獲得559個(gè)菌屬，其中56個(gè)屬尚未被注釋出具體的菌屬名。在10個(gè)樣品中所占比例均大于1%的菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）和Romboutsia菌屬。不同菌屬在不同樣品中所占比例差異較大，其中，樣品K1和K6與其他樣品差異最為明顯。

3.4 聚類分析

為研究不同樣品間的相似性，基于Weighted Unifrac距離采用非加權(quán)組平均法（UPGMA）對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析。由圖4可知，K1和K6這2個(gè)樣品的菌群與其他樣品組成差異較大。

3 討論

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法僅限于分離能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，而通過(guò)該方法鑒定的微生物僅占所研究樣品中所有微生物物種的1%～10%[15]。因此，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)分析所得到的結(jié)果并不能反映所研究樣品中微生物的多樣性。近年來(lái)，Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物腸道微生物多樣性的研究，該技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量數(shù)據(jù)，而且檢測(cè)數(shù)據(jù)完整性好[16]。

本研究采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)沐川烏骨黑雞空腸微生物菌群進(jìn)行分析，樣品稀釋曲線分析表明，10個(gè)樣本的覆蓋率均達(dá)到99.0%，說(shuō)明此次測(cè)序數(shù)據(jù)比較全面，能夠比較全面地反映10個(gè)研究對(duì)象的空腸微生物組成情況。但10羽沐川烏骨黑雞即使在相同的飼養(yǎng)和管理方式下，其空腸微生物的種類和數(shù)量也不完全相同，這可能與每個(gè)檢測(cè)

個(gè)體的宿主屬性（如身體情況、飲食習(xí)慣、自身激素水平等）有關(guān)[2]。

有關(guān)腸道微生物的研究均表明，厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）為相對(duì)豐度最高的菌門[8-9，17]，本研究結(jié)果與之一致。Torok等進(jìn)行了肉雞飼喂試驗(yàn)，結(jié)果表明厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門與肉雞生產(chǎn)性能相關(guān)[18]。厚壁菌門在健康的火雞[19]、肉雞[9]、蛋雞[17]的腸道中也是含量最多的菌群，厚壁菌門與粗飼料的消化吸收有關(guān)，對(duì)宿主體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝有重要作用。擬桿菌菌群發(fā)酵產(chǎn)物有醋酸鹽，可以刺激宿主黏液相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腸道黏液的產(chǎn)生[20]。

在物種注釋結(jié)果中屬水平上有56個(gè)屬尚未被注釋出具體的菌屬名，這表明有關(guān)雞腸道微生物在屬水平上的研究還不夠深入。腸道微生物是一個(gè)十分復(fù)雜的系統(tǒng)，即使同一批在相同的飼養(yǎng)和管理下的雞群，不同菌屬在不同個(gè)體腸道中所占比例差異也較大，每種菌屬在宿主的新陳代謝過(guò)程中均發(fā)揮著不同作用。隨著高通量測(cè)序的廣泛應(yīng)用，對(duì)腸道微生物的研究不斷深入，腸道微生物的功能研究將成為熱點(diǎn)，篩選出可提高宿主生產(chǎn)性能的有益微生物，對(duì)提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

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