凌濟(jì)忠，張玉婷，習(xí)明，華偉，江敏耀，萬躍平，萬頌*

(1.廣州市花都區(qū)花山鎮(zhèn)衛(wèi)生院外科，廣東 廣州 510880；2.廣州醫(yī)科大學(xué)南山學(xué)院，廣東 廣州 511436；3.南方醫(yī)科大學(xué)花都區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510800)

透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是腎臟惡性腫瘤中常見的病理類型[1]，以糖原水平升高和脂肪堆積為特征[2]。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PCK1)是糖異生途徑中的一個(gè)限速酶，能催化草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳，并在糖異生、絲氨酸合成和氨基酸代謝中發(fā)揮著重要的功能[3]。既往研究結(jié)果表明，PCK1在人體多種腫瘤中呈異常表達(dá)，如肝細(xì)胞癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌[4-6]，但其在ccRCC中的表達(dá)情況目前還不明確?；诖耍狙芯客ㄟ^觀察PCK1在ccRCC中的表達(dá)情況及其與患者生存率之間的相關(guān)性，旨在探討PCK1表達(dá)對(duì)預(yù)測ccRCC患者預(yù)后的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究收集30對(duì)腎癌和癌旁腎組織標(biāo)本，來源于廣州市第一人民醫(yī)院，所有病例術(shù)前未行化學(xué)治療或放射治療。

1.2 癌癥基因組圖譜

癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)(http://cancergenome.nih.gov)是美國國立癌癥研究所創(chuàng)立的腫瘤全基因組測序數(shù)據(jù)庫，包含人類約33種癌癥，其中腎癌數(shù)據(jù)庫605例，其中正常腎組織72例、ccRCC組織530例。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

本次免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)利用的PCK1抗體購于中國北京博奧森公司(貨號(hào)：bs-4972R)，組織取材后，馬上放置于10%福爾馬林中固定，隨后石蠟包埋，組織經(jīng)切片后，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色法，經(jīng)我院病理醫(yī)師確診為ccRCC后，方可用作本次研究。組織切成4 μm切片，經(jīng)二甲苯脫蠟后，隨后按酒精梯度水化(100%，95%，90%，80%，70%)，隨后經(jīng)過枸櫞酸抗原修復(fù)液(pH6.0)修復(fù)、3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶和非免疫性兔血清封閉后，按1∶100比例稀釋一抗(兔抗PCK1多克隆抗體)，放置于孵育盒中，4 ℃過夜，同時(shí)以兔抗IgG作為同型陰性對(duì)照。次日，將組織切片恢復(fù)至室溫，PBS泡洗切片，按1∶100加入羊抗兔二抗溶液，隨后加入鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，30 min后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色。染色后，進(jìn)行蘇木素復(fù)染、經(jīng)梯度酒精脫水干燥，中性樹脂封片。免疫組化評(píng)分由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分，且兩位病理醫(yī)師對(duì)患者的臨床病理信息不知情。最終評(píng)分取兩位病理醫(yī)師評(píng)分的平均值。本次免疫組織化學(xué)評(píng)分(immunoreactive score，IRS)采用強(qiáng)度+范圍評(píng)定每一例的蛋白表達(dá)水平，具體評(píng)分方法如下：每例隨機(jī)選取鏡下5個(gè)視野，根據(jù)抗體說明書，細(xì)胞質(zhì)染色定為陽性表達(dá)，根據(jù)染色強(qiáng)度(0：陰性，1：弱陽性，2：中等陽性，3：強(qiáng)陽性)和染色的比例(0：<25%，1∶25%～50%，2：50%～75%，3：>75%)來評(píng)定每一例的蛋白表達(dá)水平，IRS評(píng)分采用染色強(qiáng)度加上染色比例作為這一例的最終評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PCK1在ccRCC和癌旁組織中的mRNA和蛋白表達(dá)情況

PCK1在癌旁組織和ccRCC中的表達(dá)水平分別為5.45±1.34和3.34±0.84，兩者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)(見圖1，表1)。結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫，PCK1的mRNA表達(dá)量在癌旁組織中明顯上調(diào)，而在ccRCC組織中明顯下調(diào)(3.75±0.87vs3.37±0.16,P<0.001)，見表1。

圖1 PCK1在正常腎組織和ccRCC中的蛋白表達(dá)(*P<0.05)

2.2 PCK1表達(dá)與ccRCC臨床病理特征的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，男性、低病理分期、非轉(zhuǎn)移的和生存率高的患者中PCK1 mRNA表達(dá)水平高于女性、高病理分期、出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和低生存率的患者(P均<0.05)；但PCK1蛋白表達(dá)水平在低病理分期和高病理分期中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 PCK1表達(dá)與ccRCC臨床信息的相關(guān)性

2.3 PCK1表達(dá)與ccRCC患者生存率的相關(guān)性

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫，以PCK1 mRNA表達(dá)量中位數(shù)為分割點(diǎn)，將PCK1分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，利用Kaplan-Meier生存曲線分析PCK1與ccRCC患者總體生存率的相關(guān)性，結(jié)果顯示，高表達(dá)組總體生存率明顯高于低表達(dá)組(P<0.05)，見圖2。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中PCK1表達(dá)與ccRCC患者的生存曲線分析

2.4 PCK1表達(dá)在TCGA數(shù)據(jù)庫中的COX回歸統(tǒng)計(jì)

COX風(fēng)險(xiǎn)回歸生存模型分析結(jié)果顯示，PCK1高表達(dá)與ccRCC患者良好預(yù)后密切相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 PCK1在ccRCC病人中的總體生存COX風(fēng)險(xiǎn)回歸與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

ccRCC是人類腎臟惡性腫瘤中常見的病理類型。ccRCC的發(fā)生與發(fā)展是多階段、多因素進(jìn)程，不同的分子機(jī)制影響其進(jìn)展和預(yù)后。有研究結(jié)果顯示，果糖1,6二磷酸酶1(fructose-1,6-bisphosphatase 1，F(xiàn)BP1)是糖異生過程中的限速酶，催化1,6二磷酸果糖水解而發(fā)揮抑制作用，與ccRCC進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，這提示我們ccRCC與代謝密切相關(guān)[7-9]。

PCK基因有兩種異構(gòu)體，分別是表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)的PCK1和表達(dá)于線粒體的PCK2。目前，PCK1研究較為廣泛，PCK1基因定位于人體染色體20q13.31區(qū)域，在多種腫瘤中呈異常表達(dá)。有研究結(jié)果顯示，PCK1在肝細(xì)胞癌組織中呈低表達(dá)，且PCK1上第124位賴氨酸位點(diǎn)能被Nur77抑制其發(fā)生SUMO化修飾，從而提高PCK1基因編碼蛋白的穩(wěn)定性，增強(qiáng)糖異生，抑制糖酵解，抑制肝癌進(jìn)展[9]， Li等[10]也發(fā)現(xiàn)，PCK1的表達(dá)是黑色素瘤患者的代謝特征之一，作可為治療黑色素瘤的潛在靶點(diǎn)10。但目前PCK1在ccRCC中的表達(dá)情況尚缺乏相關(guān)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，ccRCC中PCK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較癌旁組織升高，在低病理分期和無轉(zhuǎn)移的病例中的表達(dá)水平高于高病理分期和轉(zhuǎn)移病例，這說明PCK1作為抑癌因子，其表達(dá)與ccRCC惡性程度呈負(fù)相關(guān)。通過生存分析，我們還發(fā)現(xiàn)，PCK1表達(dá)越高，ccRCC患者生存率越高，預(yù)后越好；COX風(fēng)險(xiǎn)回歸生存模型也提示，PCK1高表達(dá)患者，死亡風(fēng)險(xiǎn)較低。

綜上所述，PCK1表達(dá)與ccRCC臨床進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，有望成為該病的生物標(biāo)記物，本研究為ccRCC治療提供了新的方向，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。