岑小寧，唐乾利，黃許森，蘭海生，卓臣義，馮時(shí)，唐習(xí)強(qiáng)，韋騁，包崇嬋

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院 桂西高發(fā)病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

慢性難愈合創(chuàng)面俗稱潰瘍，我國(guó)患病率約為1.7%，給社會(huì)及患者家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。創(chuàng)面愈合結(jié)局包括再生和瘢痕修復(fù)，瘢痕修復(fù)影響美觀，且關(guān)節(jié)處會(huì)限制其活動(dòng)，因此探尋一種抑制瘢痕形成并促進(jìn)再生的方法成為研究熱點(diǎn)。皮膚再生醫(yī)療技術(shù)濕潤(rùn)暴露療法/濕潤(rùn)燒傷膏(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment，MEBT/MEBO)經(jīng)過(guò)近30年基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐，已廣泛用于各種慢性難愈合創(chuàng)面的臨床治療，但其抑制瘢痕形成和促進(jìn)組織再生的機(jī)制并未完全明了。研究發(fā)現(xiàn)多種因子參與創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(signal transduction and activator of transcription 6，STAT6)在創(chuàng)面愈合過(guò)程中起促進(jìn)瘢痕修復(fù)的作用，而細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)為STAT6的抑制因子，在創(chuàng)面修復(fù)中起抑制瘢痕形成和促進(jìn)組織再生的作用[3-5]。本研究構(gòu)建慢性難愈合創(chuàng)面大鼠模型，探討MEBT/MEBO對(duì)慢性難愈合創(chuàng)面組織STAT6和SOCS1表達(dá)的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

濕潤(rùn)燒傷膏(商品名：美寶，汕頭美寶制藥)，重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子外用凝膠(商品名：貝復(fù)新，珠海億勝)，氯胺酮(江蘇恒瑞醫(yī)藥)，甲苯噻嗪(上海安譜)。SOCS1抗體(美國(guó)Affinity)，STAT6抗體(武漢博士德)，β-actin抗體、山羊抗兔二抗(北京中杉金橋)。HiFiScriptT快速去除基因組cDNA第一條鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture熒光定量PCR試劑盒(北京康為世紀(jì))。HF-300型電子天平(日本AND)，組織切片機(jī)(德國(guó)Leitz)，X5Z-H型生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，BX61型顯微鏡(日本Olympus)，4℃低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)。免疫印跡檢測(cè)全套系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD)，超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Beckmancoulter)，酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Roche)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12周齡健康成年SPF級(jí)Wistar雄性大鼠54只，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。本研究符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)有關(guān)要求。

1.3 大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型的建立

參照趙京禹等[6]全層皮膚缺損法和沈氏改良塑料環(huán)肉芽腫定量法[7]，經(jīng)改進(jìn)后制做慢性難愈合創(chuàng)面大鼠模型。使用甲苯噻嗪、氯胺酮腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，麻醉起效后用電動(dòng)剎刀剃去背部毛發(fā)，清水擦洗背部皮膚，然后置于28～30 ℃環(huán)境中，復(fù)蘇后喂食24 h以上，待損傷作用消失后再開展實(shí)驗(yàn)。再以同樣方式麻醉大鼠，以圖章進(jìn)行建模面積標(biāo)記，沿脊柱方向于背部做一個(gè)開放性創(chuàng)面，創(chuàng)面直徑為15 mm，深度至筋膜，然后覆蓋消毒干紗布，以膠布固定。建模后注射醋酸氫化可的松8 mg/100 g，建立大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。

1.4 動(dòng)物分組及處理

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為模型組、美寶組和貝復(fù)新組，每組18只，均按上述方法建立大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型。建模后用呋喃西林液清潔創(chuàng)面，各組大鼠使用不同紗布覆蓋創(chuàng)面。(1)美寶組：創(chuàng)面敷兩層美寶紗布，根據(jù)創(chuàng)面大小裁剪紗布貼于創(chuàng)面部位，然后以兩層消毒干紗布進(jìn)行創(chuàng)面覆蓋，并以膠布進(jìn)行固定；(2)貝復(fù)新組：創(chuàng)面覆蓋兩層浸潤(rùn)貝復(fù)新的紗布，紗條裁剪及覆蓋、固定方式同美寶組；(3)模型組：創(chuàng)面外敷兩層生理鹽水紗布，紗條裁剪及覆蓋、固定方式同美寶組。

分別于建模后第3、7、14天隨機(jī)斷頸處死大鼠，每組6只。取深筋膜下層創(chuàng)面及周圍組織置于濾紙上，然后從正中間將組織標(biāo)本切開，一半以濾紙包裹置于包埋盒，10%中性福爾馬林液中存放24 h，然后取出置于70%乙醇中，存放環(huán)境為4 ℃，應(yīng)用Masson染色進(jìn)行組織病理觀察；另一半置于凍存管中液氮凍存，然后將樣品置于-80℃冰箱內(nèi)保存，用于免疫印跡和實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1創(chuàng)面愈合時(shí)間及創(chuàng)面愈合率 收集創(chuàng)面組織樣本觀察各組大鼠創(chuàng)面愈合，同時(shí)比較建模后第3、7、14天各組大鼠創(chuàng)面愈合率。于上述各時(shí)點(diǎn)分別在固定焦距下進(jìn)行創(chuàng)面拍照，使用Image J軟件測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(初始創(chuàng)面面積-觀察日創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.5.2創(chuàng)面組織病理觀察 建模后第3、7、14天，應(yīng)用Masson染色觀察創(chuàng)面組織病理改變。

1.5.3STAT6、SOCS1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 建模后第3、7、14天收集創(chuàng)面組織樣本，使用RT-qPCR檢測(cè)STAT6、SOCS1 mRNA的表達(dá)。用Trizol提取組織總RNA，行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。引物序列如下：SOCS1上游引物5’ CCGCTCCCACTCTGATTACCG 3’，下游引物5’ CGAAGCCATCTTCACGCTGA 3’；STAT6上游引物5’ GAAAGGACGGGAGGGGTTA 3’，下游引物5’ CTGAAATGAGTGGATGGAATG 3’；β-actin上游引物5’ CCTAGACTTCGAGCAAGAGA 3’，下游引物5’ GGAAGGAAGGCTGGAAG 3’。 采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

1.5.4STAT6、SOCS1蛋白表達(dá)檢測(cè) 建模后第3、7、14天收集創(chuàng)面組織樣本，分別稱重后剪碎置于冰面，予勻漿機(jī)搗碎分裝于離心管中，加入RIPA裂解液充分混勻，4℃冰箱過(guò)夜。4℃條件下12 000 r/min(離心半徑10 cm)離心10 min，取上清測(cè)定蛋白濃度。以β-actin為內(nèi)參照，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)STAT6、SOCS1蛋白表達(dá)。按說(shuō)明書制備SDS-PAGE凝膠，樣品變性后電泳，凝膠轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行檢測(cè)。膠片掃描后用Tanon Gis軟件測(cè)定各條帶吸光度值，以目的條帶與β-actin條帶的吸光度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合時(shí)間比較

美寶組與貝復(fù)新組創(chuàng)面愈合時(shí)間較模型組均明顯縮短(均P<0.05)，但兩組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合時(shí)間

2.2 創(chuàng)面愈合率比較

建模后第3天，3組創(chuàng)面愈合率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模后第7、14天，貝復(fù)新組與美寶組創(chuàng)面愈合率均高于模型組(均P<0.05)，但貝復(fù)新組與美寶組創(chuàng)面愈合率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面愈合率

2.3 各組大鼠創(chuàng)面組織病理觀察

大鼠創(chuàng)面組織行Masson染色進(jìn)行病理觀察。建模后第3天，3組大鼠創(chuàng)面組織形態(tài)學(xué)差異不明顯，創(chuàng)面組織中見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及明顯組織水腫，新生毛細(xì)血管很少。建模后第7天，美寶組和貝復(fù)新組創(chuàng)面組織均可見大量毛細(xì)血管生成，炎性細(xì)胞明顯減少，可見不成熟的毛囊結(jié)構(gòu)生成；模型組創(chuàng)面組織中仍有較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，新生毛細(xì)血管較美寶組和貝復(fù)新組少，未見毛囊結(jié)構(gòu)生成。建模后第14天，美寶組和貝復(fù)新組創(chuàng)面組織中均可見整齊排列的毛細(xì)血管及成熟的毛囊、皮脂腺等；模型組創(chuàng)面可見大量成纖維細(xì)胞及少量炎性細(xì)胞。見圖1。

圖1 不同時(shí)點(diǎn)3組大鼠創(chuàng)面組織病理觀察(Masson染色 ×100)

2.4 STAT6、SOCS1 mRNA表達(dá)檢測(cè)

建模后第3、7天，美寶組與貝復(fù)新組STAT6 mRNA表達(dá)均明顯低于模型組(均P<0.05)，而第14天3組STAT6 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模后第3、7、14天，美寶組和貝復(fù)新組STAT6 mRNA表達(dá)先降低后增高，而模型組呈持續(xù)降低(均P<0.05)。見表3。建模后第3、7天，美寶組與貝復(fù)新組SOCS1 mRNA表達(dá)均高于模型組(均P<0.05)，而第14天3組SOCS1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模后第3、7、14天，美寶組和貝復(fù)新組SOCS1 mRNA表達(dá)先升高后降低，而模型組持續(xù)升高(均P<0.05)。見表4。

表3 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面組織STAT6 mRNA表達(dá)

表4 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面組織SOCS1 mRNA表達(dá)

2.5 STAT6、SOCS1蛋白表達(dá)檢測(cè)

建模后第3、7、14天，美寶組與貝復(fù)新組STAT6蛋白表達(dá)均低于模型組(均P<0.05)。建模后第3、7、14天，美寶組和貝復(fù)新組STAT6蛋白表達(dá)先降低后增高，而模型組呈持續(xù)降低(均P<0.05)。建模后第3、7天，美寶組與貝復(fù)新組SOCS1蛋白表達(dá)均明顯高于模型組(均P<0.05)，而第14天3組SOCS1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模后第3、7、14天，美寶組和貝復(fù)新組SOCS1蛋白表達(dá)先升高后降低，而模型組呈持續(xù)升高(均P<0.05)。見圖2，表5，表6。

注：1：美寶組；2：貝復(fù)新組；3：模型組

表5 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面組織STAT6蛋白表達(dá)

表6 不同時(shí)點(diǎn)各組大鼠創(chuàng)面組織SOCS1蛋白表達(dá)

3 討論

慢性難愈合創(chuàng)面嚴(yán)重危害人類健康，多發(fā)生于糖尿病、創(chuàng)傷、神經(jīng)病變、截癱、長(zhǎng)期臥床等患者[8]，不僅影響患者生活質(zhì)量，造成經(jīng)濟(jì)損失，長(zhǎng)期存在甚至有癌變風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。目前關(guān)于慢性難愈合創(chuàng)面的修復(fù)機(jī)制尚不完全清楚，臨床療效仍不能令人滿意，尋找安全有效的治療措施有重要的意義。唐乾利等[11-14]將MEBT/MEBO應(yīng)用于慢性創(chuàng)面顯示療效顯著，但具體機(jī)制仍不明確，本研究觀察MEBT/MEBO對(duì)慢性創(chuàng)面組織STAT6和SOCS1表達(dá)的影響，以探討其作用機(jī)制。

哺乳動(dòng)物因再生能力有限，其創(chuàng)面愈合以疤痕愈合為主。研究顯示，2型固有免疫反應(yīng)可促進(jìn)纖維化的產(chǎn)生，在促進(jìn)損傷組織纖維化中發(fā)揮著重要作用[15]。2型固有免疫反應(yīng)以2型輔助型T細(xì)胞(Th2)相關(guān)的白細(xì)胞介素4(IL-4)、IL-13最具代表性，IL-4/IL-13信號(hào)通路的激活可促進(jìn)IL-4受體(IL-4R)的表達(dá)，并進(jìn)一步激活STAT6的表達(dá)[15-16]。STAT6在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中起到促進(jìn)瘢痕修復(fù)的作用，STAT6能夠誘導(dǎo)SOCS1的表達(dá)，SOCS1通過(guò)抑制STAT6的活化來(lái)阻礙Th2的分化成熟[3-4]。因此，SOCS1介導(dǎo)的JAK激酶活性抑制能負(fù)調(diào)控STAT6的功能，而SOCS和JAK激酶競(jìng)爭(zhēng)激活STAT則為STAT6的負(fù)反饋控制。Heller等[5]報(bào)道，誘導(dǎo)SOCS1表達(dá)可通過(guò)IFN-γ/STAT1通路沉默STAT6表達(dá)，因此SOCS1在慢性創(chuàng)面修復(fù)中起促進(jìn)皮膚再生、抑制瘢痕修復(fù)的作用。

本研究顯示，美寶組與貝復(fù)新組創(chuàng)面愈合率均較模型組升高，創(chuàng)面愈合時(shí)間均較模型組縮短，且兩組病理學(xué)形態(tài)改善均優(yōu)于模型組；免疫印跡及RT-qPCR顯示MEBT/MEBO能夠顯著降低慢性難愈合創(chuàng)面組織STAT6 mRNA及蛋白表達(dá)，增加SOCS1 mRNA及蛋白表達(dá)。目前對(duì)IL-4/IL-13/STAT6通路的研究主要集中在哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、肝硬化等疾病，在創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域的研究較少。有研究顯示抑制STAT6通路可降低炎癥反應(yīng)，促毛細(xì)血管生成，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，提高愈合率[17-19]，與本研究結(jié)果一致。

綜上述，本研究成功建立慢性難愈合創(chuàng)面大鼠模型，發(fā)現(xiàn)MEBT/MEBO可通過(guò)調(diào)控創(chuàng)面組織中STAT6和SOCS1的表達(dá)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。但由于本研究?jī)H進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有待開展臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。