金秋芳 梁國(guó)強(qiáng) 葛惠男 包曉敏 孫 柳 惲海峰

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院保健科，江蘇 蘇州 215009)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，病變主體在肝小葉，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜臺(tái)征，常伴有肥胖或超質(zhì)量，很容易發(fā)展為肝硬化，繼而轉(zhuǎn)為肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。當(dāng)前研究表明，NAFLD負(fù)向轉(zhuǎn)歸進(jìn)展過(guò)程中，大量肝細(xì)胞線粒體存在受損情況，而細(xì)胞內(nèi)存在的自噬機(jī)制能夠清除受損的亞細(xì)胞器，維持肝細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，是細(xì)胞存活的關(guān)鍵[2]，自噬可降解肝細(xì)胞內(nèi)脂滴，減輕炎性反應(yīng)，改善肝細(xì)胞脂肪變性[3]。依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶(NAD+)的沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)可調(diào)節(jié)多種與線粒體增殖和自噬相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及活性，對(duì)維持肝細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡具有極其緊密的關(guān)聯(lián)性[4]。臨床實(shí)踐及既往研究發(fā)現(xiàn)，單純控制飲食、適度的有規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)可延緩NAFLD的病理進(jìn)展，并最終改善患者生存質(zhì)量，對(duì)于改善肝臟脂質(zhì)代謝紊亂、外周胰島素抵抗(IR)和機(jī)體的抗氧化能力降低等均有一定作用，但仍存在患心血管疾病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。

中醫(yī)防治NAFLD越來(lái)越顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，與現(xiàn)代的運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)和康復(fù)醫(yī)學(xué)等既有交叉又有特色。未病先防、既病防變和瘥后防復(fù)為中醫(yī)倡導(dǎo)“治未病”的主要思想，通過(guò)飲食起居、情志調(diào)理、運(yùn)動(dòng)療法及中醫(yī)藥等多種措施調(diào)節(jié)人體的陰陽(yáng)氣血平衡，增強(qiáng)抗病能力[7]。葛根素是中藥葛根的主要活性成分，藥理研究表明其有改善心血管功能、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、降低血糖和改善IR的作用[8]。目前多數(shù)研究?jī)H對(duì)飲食運(yùn)動(dòng)或藥物單方面干預(yù)NAFLD的作用機(jī)制進(jìn)行研究，缺乏運(yùn)動(dòng)聯(lián)合中藥主要成分對(duì)SIRT1介導(dǎo)肝細(xì)胞自噬的保護(hù)作用研究。因此，我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究葛根素聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD大鼠肝細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白調(diào)控的影響，同時(shí)觀察SIRT1介導(dǎo)細(xì)胞自噬的交互機(jī)制，探討其治療作用和可能機(jī)制，為中藥活性成分聯(lián)合運(yùn)動(dòng)防治NAFLD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠53只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0043。自由攝食、飲水，室溫24±2 ℃，明暗各半。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 葛根素(阿拉丁控股集團(tuán)有限公司)；羥甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司)；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)測(cè)定試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)；蘇木素、伊紅(廣州鴻泉生物科技有限公司)；戊二醛固定液、鋨酸固定液、醋酸鈾染色液、檸檬酸鉛染色液(阿拉丁控股集團(tuán)有限公司)；Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ抗體[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]；p62(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；SIRT1抗體(美國(guó)GeneTex公司)；廣譜二抗(上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司)；多聚甲醛(上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司)；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 大鼠有氧運(yùn)動(dòng)游泳箱(吳門醫(yī)派研究院中心實(shí)驗(yàn)室自制，1.5 m×1.0 m×0.5 m)；全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)杜邦公司)；酶標(biāo)儀(Infinite F50型，瑞士Tecan公司)；石蠟切片機(jī)、攤片機(jī)(湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司)；超薄切片機(jī)(LKB-V型，瑞典LKB公司)；透射電鏡(H-600型，日本日立公司)；數(shù)碼相機(jī)(D5100型，日本NIKON公司)；正置顯微鏡(CX41型，OLYMPUS公司)；聚偏二氟乙烯(PVDF，邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司)；TBST(Tris-HCl，NaCl，tween20)緩沖液[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；超敏化學(xué)發(fā)光(ECL)液(美國(guó)默克公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將53只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組10只，造模組43只。

1.2.2 造模 造模組43只大鼠予高脂飼料(普通飼料+豬油100 g/kg+膽固醇20 g/kg)，自由飲水；空白組10只大鼠予普通飼料飲食。均喂養(yǎng)10周。最后1次喂養(yǎng)結(jié)束后，從造模組大鼠中隨機(jī)選取3只大鼠，處死驗(yàn)證造模成功[9]。隨后將造模組剩余40只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、葛根素組、運(yùn)動(dòng)組及葛根素+運(yùn)動(dòng)組，各10只。

1.2.3 給藥方法 葛根素組、葛根素+運(yùn)動(dòng)組大鼠予葛根素250 mg/kg(葛根素以0.5%羥甲基纖維素鈉溶解為25 mg/mL混懸液)，灌胃容積為10 mL/kg，每日上午灌胃給藥，現(xiàn)用現(xiàn)配；空白組、模型組、運(yùn)動(dòng)組大鼠予等容積的雙蒸水灌胃，每日1次。均灌胃4周。運(yùn)動(dòng)組、葛根素+運(yùn)動(dòng)組大鼠于第1、2、3 d在水溫28～32 ℃有氧運(yùn)動(dòng)游泳箱內(nèi)分別適應(yīng)性游泳30、60、90 min，以后運(yùn)動(dòng)方案固定，參照文獻(xiàn)[10]，每日固定時(shí)間(上午9：00左右開(kāi)始)游泳90 min，每周運(yùn)動(dòng)5 d，持續(xù)4周?？瞻捉M、模型組、葛根素組大鼠關(guān)在籠中不運(yùn)動(dòng)。

1.2.4 標(biāo)本制作 末次灌胃干預(yù)后，禁食不禁水18 h，以戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，分離血清并用凍存管分裝，置于-80 ℃冰箱中保存；采血后解剖摘取肝臟。剪取肝組織約0.5 cm3若干塊，置于10%多聚甲醛液固定，用于制作病檢標(biāo)本。另摘取小塊肝組織，戊二醛固定液固定(4 ℃保存)，待透射電鏡下觀察線粒體及自噬體超微結(jié)構(gòu)。余下肝組織，-80 ℃保存，待蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)法測(cè)定相關(guān)蛋白。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 在全自動(dòng)生化分析儀上采用甘油磷酸氧化酶-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)(GPO-PAP)比色法檢測(cè)血清TG、TC，雙試劑直接法檢測(cè)HDL-C、LDL-C；采用紫外比色法檢測(cè)血清ALT、AST，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平。

1.3.2 肝組織正置顯微鏡、電鏡病理形態(tài)學(xué)觀察 取各組經(jīng)10%多聚甲醛液固定的肝組織，采用蘇木素-伊紅(HE)染色法，進(jìn)行脫水透明、浸蠟包埋、切片、脫蠟、染色、封固后，正置顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)及脂滴分布狀況,并采用數(shù)碼相機(jī)拍照。另取戊二醛固定液固定的肝組織，依次行鋨酸固定、脫水包埋、使用超薄切片機(jī)切片、醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，根據(jù)要求進(jìn)行透射電鏡觀察拍照分析。

1.3.3 肝組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、SIRT1蛋白檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)法檢測(cè)肝組織Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、SIRT1蛋白表達(dá)，取肝組織裂解、勻漿后留取上清，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫孵育1 h，封閉過(guò)的膜對(duì)應(yīng)抗體，4 ℃過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜，然后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜。與ECL試劑作用，X線攝片記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以GADPH為內(nèi)參照，采用imag J圖像處理軟件測(cè)定蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠治療前后體質(zhì)量比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠治療前后體質(zhì)量比較

由表1可見(jiàn)，治療前后模型組、葛根素組、運(yùn)動(dòng)組、葛根素+運(yùn)動(dòng)組大鼠體質(zhì)量均高于空白組(P<0.05)。治療后葛根素組、運(yùn)動(dòng)組、葛根素+運(yùn)動(dòng)組大鼠體質(zhì)量均低于模型組(P<0.05)；葛根素+運(yùn)動(dòng)組大鼠體質(zhì)量均低于葛根素組、運(yùn)動(dòng)組(P<0.05)；治療后葛根素與運(yùn)動(dòng)組大鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠治療后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，模型組TC、LDL-C均高于空白組(P<0.05)，HDL-C低于空白組(P<0.05)；葛根素組、運(yùn)動(dòng)組、葛根素+運(yùn)動(dòng)組TG、TC、LDL-C均低于模型組(P<0.05)，HDL-C雖高于模型組但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。運(yùn)動(dòng)組TC高于葛根素組(P<0.05)，葛根素+運(yùn)動(dòng)組TC、LDL-C均低于葛根素組(P<0.05)。葛根素+運(yùn)動(dòng)組TC、LDL-C均低于運(yùn)動(dòng)組(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較

2.3 各組大鼠治療后血清AST、ALT及IL-1β、TNF-α水平比較 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠治療后血清AST、ALT及IL-1β、TNF-α水平比較

由表3可見(jiàn)，與空白組比較，模型組AST、ALT、IL-1β、TNF-α水平均明顯升高(P均<0.05)；與模型組比較，干預(yù)各組AST、ALT、IL-1β水平均明顯下降(P<0.05)，葛根素+運(yùn)動(dòng)組TNF-α水平明顯下降(P<0.05)；與葛根素組比較，運(yùn)動(dòng)組AST、ALT、IL-1β、TNF-α水平均上升但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；葛根素+運(yùn)動(dòng)組AST、ALT、IL-1β、TNF-α水平均低于葛根素組、運(yùn)動(dòng)組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察

2.4.1 鏡下(HE染色)結(jié)果 空白組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)良好，肝板排列整齊，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪變，細(xì)胞核圓形均質(zhì)紅染；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝板排列紊亂，可見(jiàn)肝細(xì)胞肥大呈氣球樣變和脂肪空泡性變，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并且部分肝細(xì)胞核則被脂滴擠得明顯偏位；與模型組比較，干預(yù)各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變均有不同程度的改善，以葛根素+運(yùn)動(dòng)組改善最為明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)和肝板大多排列趨向良好和整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪滴明顯減少。見(jiàn)封2，圖1。

2.4.2 透射電鏡結(jié)果 空白組的肝細(xì)胞整體清晰，線粒體結(jié)構(gòu)正常，嵴機(jī)構(gòu)和內(nèi)外膜完整，各細(xì)胞器排列分布均正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、細(xì)胞器豐富，自噬結(jié)構(gòu)體偶見(jiàn)。模型組電鏡下可見(jiàn)脂滴彌漫性分布，肝細(xì)胞可見(jiàn)大小不一的空泡細(xì)胞和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，核糖體脫落，線粒體數(shù)量增加且形態(tài)異常變扁圓，各細(xì)胞器存在缺失情況，多成無(wú)序排列，可見(jiàn)少量自噬體結(jié)構(gòu)。與模型組比較，干預(yù)各組的肝細(xì)胞內(nèi)部脂質(zhì)體相對(duì)減少，線粒體空泡化、不規(guī)則性的異常變化均有不同程度的改善，且細(xì)胞輪廓趨向正常，以運(yùn)動(dòng)+葛根素組自噬溶酶體及被包裹的內(nèi)容物明顯增多。見(jiàn)封2，圖2。

2.5 各組大鼠肝組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p62、SIRT1蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠肝組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1、p62、SIRT1蛋白表達(dá)比較

由表4可見(jiàn)，模型組大鼠肝組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p62、SIRT1表達(dá)均高于空白組(P<0.05)。葛根素組、運(yùn)動(dòng)組、葛根素+運(yùn)動(dòng)組大鼠肝組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均低于模型組(P<0.05)，葛根素組、葛根素+運(yùn)動(dòng)組大鼠肝組織Beclin-1均高于模型組(P<0.05)，葛根素組、葛根素+運(yùn)動(dòng)組大鼠肝組織p62均低于模型組(P<0.05)，葛根素組、運(yùn)動(dòng)組、葛根素+運(yùn)動(dòng)組大鼠肝組織SIRT1均高于模型組(P<0.05)。與葛根素組比較，葛根素+運(yùn)動(dòng)組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，運(yùn)動(dòng)組Beclin-1降低，p62運(yùn)動(dòng)組升高，葛根素+運(yùn)動(dòng)組降低(P均<0.05)。與運(yùn)動(dòng)組比較，葛根素+運(yùn)動(dòng)組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1均升高，p62降低(P均<0.05)。

3 討 論

現(xiàn)代社會(huì)人們飲食結(jié)構(gòu)多樣，NAFLD、2型糖尿病和代謝綜合征等與IR相關(guān)的代謝性疾病逐年增加。隨著全民健康意識(shí)的不斷提高，合理膳食、運(yùn)動(dòng)已廣泛應(yīng)用于多種疾病的防治中[11]。有文獻(xiàn)分析及前期研究表明，現(xiàn)代運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等防治NAFLD發(fā)揮了重要作用[12]，與傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)“未病先防、既病防變”理念不謀而合。單純的中藥活性成分治療可明確降低血脂，改善肝損傷，配合規(guī)律性的有氧運(yùn)動(dòng)后，可改善肝細(xì)胞功能，在降低血脂、改善IR情況下，改善脂肪在肝臟內(nèi)沉積[13]。本實(shí)驗(yàn)采用高脂膳食誘導(dǎo)的NAFLD模型大鼠進(jìn)行4周干預(yù)研究，結(jié)果顯示葛根素聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)可明顯降低NAFLD模型大鼠體質(zhì)量及血脂、肝功能、炎癥因子指標(biāo)，病理組織學(xué)改變也得到明顯改善，與既往關(guān)于葛根素或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)脂肪肝的研究結(jié)果一致[14]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，NAFLD的主要誘因之一是肝細(xì)胞線粒體功能障礙，主要體現(xiàn)為肝細(xì)胞線粒體中超微結(jié)構(gòu)損傷及自噬體階段性浮動(dòng)變化等[15]。本實(shí)驗(yàn)的肝細(xì)胞線粒體及自噬體超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，NAFLD大鼠肝組織電鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞脂滴彌漫性分布，大小不一的空泡性細(xì)胞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、核糖體脫落和線粒體數(shù)量增加及形態(tài)扁圓等細(xì)胞器缺失的情況，又可見(jiàn)少量自噬體結(jié)構(gòu)[16]。葛根素聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)下可明顯改善線粒體損傷，同時(shí)觀察到自噬溶酶體及被包裹的內(nèi)容物明顯增多。進(jìn)一步的Western Blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組比較，葛根素+運(yùn)動(dòng)組肝細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62表達(dá)下調(diào)，Beclin-1表達(dá)上調(diào)，p62和Beclin-1理論上雖然優(yōu)于單一干預(yù)的葛根素組和運(yùn)動(dòng)組，但LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于單一干預(yù)的葛根素組和運(yùn)動(dòng)組，提示葛根素聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)NAFLD大鼠肝細(xì)胞自噬保護(hù)作用尚需進(jìn)一步研究[17]。

SIRT1作為組織細(xì)胞中沉默信息調(diào)節(jié)因子2家族成員之一，主要是NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶，是其自我保護(hù)的一種重要分子，在機(jī)體細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、凋亡和新陳代謝等方面的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，在NAFLD肝組織內(nèi)通過(guò)蛋白質(zhì)和組蛋白的去乙?；瘜?dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)功能的上調(diào)或下調(diào)，能提高線粒體的生物源和功能，也能導(dǎo)致各種代謝途徑的改變[18]。本實(shí)驗(yàn)Western Blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組肝組織中SIRT1表達(dá)與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，葛根素組、運(yùn)動(dòng)組、葛根素+運(yùn)動(dòng)組SIRT1表達(dá)均明顯上調(diào)。既往研究SIRT1去乙酰化活性的調(diào)控作用已被證明對(duì)NAFLD的病理生理機(jī)制存在一定關(guān)聯(lián)性，尤其對(duì)細(xì)胞自噬、凋亡均具有積極作用[19]。因此提示，葛根素聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)協(xié)同調(diào)節(jié)SIRT1-肝細(xì)胞自噬通路，改善NAFLD轉(zhuǎn)歸，機(jī)制可能為作用肝細(xì)胞SIRT1信號(hào)通路，提高SIRT1的表達(dá)和活性。推斷其通過(guò)去乙?；饔枚种坪宿D(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)p62蛋白積聚或激活自噬小體的形成等，調(diào)控自噬的相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)入程序性死亡，而防止非程序性死亡。

隨著對(duì)NAFLD研究的不斷深入和人們健康意識(shí)的不斷提高，結(jié)合體育運(yùn)動(dòng)和傳統(tǒng)中醫(yī)治未病“先安未受邪之地”的思想，加強(qiáng)相應(yīng)的干預(yù)研究是必然趨勢(shì)。有規(guī)律、合適的運(yùn)動(dòng)配合藥食同源的植物活性成分可協(xié)同降低NAFLD風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究葛根素聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)協(xié)同緩解NAFLD“二次打擊”的惡性循環(huán)的進(jìn)程，調(diào)控SIRT1介導(dǎo)細(xì)胞自噬的抗NAFLD分子機(jī)制，探討抗NAFLD過(guò)程中可能的靶點(diǎn)、途徑及調(diào)控機(jī)制，為有效的中藥活性成分聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)防治NAFLD提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)具有積極意義。