高曉斌 武雪亮 趙軼峰 聶雙發(fā) 梁 峰 劉小飛 竇金山 張迎春

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院小兒外科，河北張家口 075000；3.河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北張家口 075000

據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，2014 年我國居民結(jié)直腸癌發(fā)病例數(shù)位居第五，嚴重威脅國民健康[1]。結(jié)直腸癌的早期診斷、規(guī)范化治療和預(yù)后監(jiān)測，對患者生存時間、生活質(zhì)量有著重要影響。從分子生物學(xué)水平，尋找精準度高、特異性強的標志物已成為結(jié)直腸癌診療領(lǐng)域的研究熱點，同時為腫瘤的靶向治療提供新的技術(shù)支撐[2-4]。

DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）是人類表觀遺傳學(xué)中催化并維持DNA 基化結(jié)構(gòu)和功能的重要酶家族[5]。DNMTs包含3個重要成員：DNMT1、DNMT2 和DNMT3，其中DNMT1 是目前研究最為廣泛也最為深入的酶類，其在DNA 修復(fù)和正常甲基化功能過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；DNMT2 主要負責(zé)tDNA 的甲基轉(zhuǎn)移，DNMT3 內(nèi)含3 個亞基，3a、3b 和3L，3a、3b 與啟動子區(qū)CpG 島、DNA 的異常甲基化關(guān)系密切，而3L 系調(diào)節(jié)蛋白[6]。研究證實，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 的活性增強或表達上調(diào)能介導(dǎo)DNA 異常甲基化，與人類諸多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-10]，但在結(jié)直腸癌中的研究較少。本研究通過對結(jié)直腸癌和正常組織中DNMT1、DNMT3a 行實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）和免疫組織化學(xué)檢測分析，旨在探討二者在結(jié)直腸癌中的表達情況及與相關(guān)臨床病理因素間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測提供可靠的分子生物學(xué)標志物，為結(jié)直腸癌的靶向診療提供科學(xué)參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

共納入2017 年2 月～2018 年2 月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）普通外科手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的結(jié)直腸癌組織（癌組）和癌旁正常組織（正常組）標本，各50 例，同時收集患者完整的臨床資料。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑和儀器

RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑購自日本Takara 公司；PCR 試劑盒、PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒購自日本Takara公司；DNMT1、DNMT3a 和β-actin 引物由生工生物（北京）有限公司設(shè)計合成；全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自瑞士羅氏公司E2010；DEPC 水購自美國Sigma 公司；兔抗人DNMT1 單克隆抗體、兔抗人DNMT3a 多克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 qRT-PCR 按TRIzol RNA 試劑盒說明書提取總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 2 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR 擴增，PCR 擴增引物如下，DNMT1 正向引物：5′-CGATGAGGAAGTCGATGATAACAT-3′，反向引物：5′-ATGCGATTCTTGTTCTGTTTCTTCT-3′；DNMT3a 正向引物：5′-GCCCAAGGTCAAGGAGATTATTG-3′，反向引物：5′-TCTGCCGCACCTCGTACAC-3′；β-actin 作為內(nèi)參，正向引物：5′-AGGAAGCTTCCAGACACGC-3′，反向引物：5′-CGCACTGCCATTTTAGCTCC-3′。PCR 反應(yīng)條件：95℃變性10 min，進行40 個循環(huán)：95℃變性15 s，60℃退火2 s，72℃延伸40 s，然后根據(jù)SYBRGreen 染色法行相對定量分析，熒光定量PCR 實驗數(shù)據(jù)處理使用2-△△Ct法。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法 將癌組織標本連續(xù)切片4 μL貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50 min，光鏡下觀察切片中DNMT1、DNMT3a 蛋白的表達和分布情況，每張切片選取5 個高倍視野（400×）。DNMT1 蛋白陽性主要分布于細胞核中，而DNMT3a蛋白陽性主要分布于細胞質(zhì)和細胞膜中，均呈棕黃色顆粒。判斷標準：按染色強度，無著色為0 分，淡黃為1 分，深黃2 分，棕褐或棕黃3 分；陽性細胞計數(shù)，＜10%為0 分，10%～＜25%為1 分，25%～＜50%為2 分，50%～＜75%為3 分，≥75%為4 分。兩者相加＜2 分為陰性（-），2～3 分為弱陽性（+），4～5 分為中等強度陽性（++），6～7 分為強陽性（+++），由兩名具備高級職稱的病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法獨立評分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用t 檢驗，計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗。相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中DNMT1 mRNA、DNMT3a mRNA 表達

以目標基因與β-catenin 的比值作為qRT-PCR定量分析結(jié)果，癌組中DNMT1 mRNA 的表達水平（0.36±0.07）明顯高于正常組（0.09±0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.951，P=0.000）；癌組中DNMT3a mRNA 的表達水平（0.33±0.06）明顯高于正常組（0.11±0.02），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.724，P=0.000）。

2.2 結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中DNMT1 和DNMT3a 蛋白的表達

免疫組化結(jié)果顯示，癌組中DNMT1 蛋白陽性表達為84.00%（42/50），明顯高于其在正常組中的表達[24.00%（12/50）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.545，P=0.000）；癌組中DNMT3a 蛋白陽性表達為78.00%（39/50），明顯高于其在正常組中的表達[30.00%（15/50）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.433，P=0.000）。見圖1。

圖1 DNMT1、DNMT3a 在結(jié)直腸正常組織和癌組織中的表達（SP，200×）

2.3 DNMT1 和DNMT3a 蛋白表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

DNMT1 和DNMT3a 蛋白表達均與腫瘤的浸潤深度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移相關(guān)（均P ＜0.05）。TNM 分期越高，二者的表達水平越高（均P ＜0.05），伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移的患者二者的表達水平明顯高于未轉(zhuǎn)移的患者（均P ＜0.05），而二者的表達水平與患者腫瘤大小、分化程度均無相關(guān)性（均P ＞0.05）。見表1。

表1 DNMT1 和DNMT3a 蛋白表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.4 結(jié)直腸癌組織中DNMT1 和DNMT3a 蛋白表達的相關(guān)性

DNMT1 和DNMT3a 蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.455，P=0.000）。見圖2。

圖2 結(jié)直腸癌組織中DNMT1 和DNMT3a 蛋白的相關(guān)性

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多個基因調(diào)控的多步驟、多階段的復(fù)雜病變過程，其中抑癌基因的失活和致癌基因的激活發(fā)揮關(guān)鍵作用，其病變機制涉及表觀遺傳學(xué)的改變，包括DNA 甲基化、染色體重塑、組蛋白修飾和lncRNA 調(diào)控[11-14]，其中DNA 甲基化是目前研究最為深入的機制。

DNMT1 是由Bestor 等[15]于1988 年在真核生物中克隆出胞嘧啶特異DNA 轉(zhuǎn)移酶，即DNMT1。DNMT1 定位于人染色體19p13.2～19p13.3，內(nèi)含1616 個氨基酸殘基，相對分子量為183×103，包括3 個結(jié)構(gòu)域，即N 端的某些特定蛋白識別靶區(qū)域、C 端的催化端和相對的未知區(qū)域[16-17]。DNMT1 主要介導(dǎo)甲基化模式的建立與維護，而DNMT3a 主要負責(zé)從頭甲基化，二者高表達可以誘導(dǎo)甲基化模式異常、致癌基因激活和抑癌基因沉默，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)DNMT1 在人類諸多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。DNMT1 是DNA 甲基化的關(guān)鍵作用酶，其活性的增加能促進DNA 異常甲基化。Li 等[18]通過對胰腺癌組織和相應(yīng)正常組織行免疫印跡和免疫組化法檢測，發(fā)現(xiàn)約80%、78.7%的癌組織中DNMT1呈高表達狀態(tài)，表明DNMT1 的異常高表達與胰腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。Yang 等[19]應(yīng)用采用免疫組織化學(xué)法檢測54 例胃癌患者石蠟切片中DNMT1 和DNMT3a的表達，發(fā)現(xiàn)DNMT1、DNMT3a 在胃癌組織中的過表達分別為54 例（64.8%）、38 例（70.4%），且二者與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。馮悅靜等[20]應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測136 例肺癌患者和147 名健康對照者中DNMT1 和DNMT3a 的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)二者蛋白表達水平均顯著高于正常對照組，進一步logistic 回歸結(jié)果證實，二者蛋白的高表達能增加肺癌的發(fā)病率。

本研究顯示DNMT1 和DNMT3a 在結(jié)直腸癌組織中表達明顯高于正常組，表明在腸黏膜癌變的過程中，細胞核中的DNMT1 和細胞質(zhì)、細胞膜上的DN MT3a 水平逐步上調(diào)，啟動DNA 異常甲基化過程，相應(yīng)的調(diào)控基因表達受抑制，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；進一步研究顯示，DNMT1 和DNMT3a 表達水平與結(jié)直腸癌的浸潤深度、TNM 分期、淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移均明顯相關(guān)，且二者表達呈明顯正相關(guān)，提示DNMT1 和DNMT3a的表達與結(jié)直腸癌的臨床病理參數(shù)相關(guān)，二者共同參與建立、維持整個DNA 甲基化模式的過程，二者表達越高，病變越嚴重、預(yù)后越差。DNMT1 和DNMT3a同時作用的甲基化酶效應(yīng)是各自單獨作用的近5 倍，DNMT3a 介導(dǎo)從頭甲基化的啟動后，半甲基化DNA底物激活DNMT1 活性使之完成后續(xù)的甲基化修飾；而DNMT1 能夠催化未修飾的DNA 發(fā)生甲基化，DNMT3a 的從頭甲基化活性則是通過甲基化的DNA 與DNMT1 酶位于N 端的變構(gòu)位點的靶向結(jié)合而被激活的。

綜上，DNMT1 和DNMT3a 的異常表達對結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展有重要作用。本研究僅從基因和蛋白水平分析二者在結(jié)直腸癌組織中的表達情況，其具體的異常甲基化作用機制及相關(guān)通路的研究尚不明確，這也是筆者下一步的研究方向。