宋紹征 陸睿 張婷 何正義 吳趙曼秋 成勇 周鳴鳴

（1. 無(wú)錫太湖學(xué)院護(hù)理學(xué)院，無(wú)錫 214000；2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，制藥工程學(xué)院，淮安 223003；3. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥工程研究中心，揚(yáng)州 225009）

基因編輯技術(shù)是指對(duì)生物體基因組特定DNA進(jìn)行精確敲除、定點(diǎn)插入或突變等，使被編輯的生物體性狀定向改變且能夠穩(wěn)定遺傳的技術(shù)，現(xiàn)被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)藥、基因工程和動(dòng)植物分子精準(zhǔn)遺傳育種等領(lǐng)域研究［1-3］。該技術(shù)經(jīng)歷了同源重組、RNA干擾、鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/相關(guān)蛋白9（CRISPR/Cas9）技術(shù)等幾代發(fā)展。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新型的第三代基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，只需改變較短的sgRNA序列便可引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)行定點(diǎn)精準(zhǔn)編輯，相比于其它傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，具有簡(jiǎn)化構(gòu)建過(guò)程、高效、精準(zhǔn)、特異等良好特點(diǎn)，受到國(guó)內(nèi)外眾多科學(xué)研究者的青睞，尤其是在畜牧業(yè)遺傳育種領(lǐng)域中已成功地用于多種動(dòng)物的基因改造和物種性狀改良［2］。

山羊和綿羊不僅是重要的經(jīng)濟(jì)家畜，而且也成為重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，國(guó)內(nèi)外早已有羊體細(xì)胞克隆和基因修飾的報(bào)道，被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和動(dòng)物遺傳育種等研究領(lǐng)域。由于羊具有性情溫順，肉質(zhì)鮮嫩，繁殖率高、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行基因編輯可培育優(yōu)良品種，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，獲得優(yōu)質(zhì)的肉、奶和羊絨等農(nóng)副產(chǎn)品［3］。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)出現(xiàn)后，便快速地應(yīng)用于羊的基因編輯研究。本文重點(diǎn)對(duì)CRISPR /Cas9基因編輯技術(shù)及在羊乳“人源化”改造、提高肉品質(zhì)、改善絨毛纖維品質(zhì)等方面的應(yīng)用研究進(jìn)展及前景作簡(jiǎn)要闡述。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

1.1 CRISPR/Cas9的概述

CRISPR/Cas9是基于古生菌和細(xì)菌抵御外來(lái)質(zhì)體或病毒的遺傳物質(zhì)防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)中CRISPR相關(guān)酶（Cas）在序列識(shí)別處可切割外源基因組DNA［4］。用于基因編輯，由sgRNA序列引導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶特異性地識(shí)別靶基因位點(diǎn)，從而剪切雙鏈DNA，通過(guò)非同源末端連接和同源重組的修復(fù)獲得基因突變體，是近年興起的一項(xiàng)新型基因編輯技術(shù)，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因、基因敲除及基因打靶等個(gè)體或細(xì)胞組織的基因定點(diǎn)修飾［5-6］。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)于1987年，由日本大阪大學(xué)的Ishino等［7］在K12型大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一段特殊DNA回文序列，但是當(dāng)時(shí)并未闡釋這段序列的功能。2002年，Jansen 等［8］將上述序列正式命名為“成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）”。直到2008年，CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)DNA的精準(zhǔn)切割機(jī)理才逐漸被人們所認(rèn)識(shí)［9］。2013年，張峰［5］和 Church等［6］首次利用CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)小鼠和人類(lèi)細(xì)胞基因編輯研究，成功實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物基因組的定點(diǎn)修飾，該技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用和推崇，連續(xù)兩年被Science雜志評(píng)為“年度十大科學(xué)突破之一”。2015年，麻省理工學(xué)院McGovern腦研究所和哈佛醫(yī)學(xué)院Broad研究所通過(guò)設(shè)計(jì)改造CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，大大地降低了該系統(tǒng)的“脫靶”效應(yīng)，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)得到了進(jìn)一步完善和改進(jìn)［10］。此后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)迅速成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，眾多的研究成果被各種相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和轉(zhuǎn)載［11-14］。

1.2 CRISPR/Cas9的作用機(jī)理

CRISPR/Cas系統(tǒng)是由3'端的重復(fù)間隔序列（CRISPR）和5'端的編碼Cas蛋白操縱子兩部分組成［3］。該系統(tǒng)具有切割DNA的能力，分為獲取間隔序列、基因座表達(dá)、切割外源DNA三個(gè)階段。獲取間隔序列階段是指外源物質(zhì)入侵細(xì)菌時(shí)，利用Cas蛋白復(fù)合物將外源基因切割加工成一種新的重復(fù)間隔序列，從而整合到CRISPR重復(fù)序列簇內(nèi)儲(chǔ)存“記憶”?；蜃磉_(dá)階段是指細(xì)菌轉(zhuǎn)錄形成precrRNA，反式編碼小RNA（tracrRNA）與Cas蛋白相互作用形成雙鏈RNA，進(jìn)一步被核酸內(nèi)切酶剪切成為小的成熟RNA（crRNA）。切割外源DNA階段是指crRNA、tracrRNA和Cas蛋白結(jié)合形成三聚復(fù)合體，特異性識(shí)別PAM序列，從而切割斷裂DNA雙鏈，引發(fā)機(jī)體內(nèi)基因修復(fù)機(jī)制［4］。

目前的CRISPR/Cas9系統(tǒng)經(jīng)人工改造后是一種應(yīng)用更簡(jiǎn)單、適用性更廣泛的基因編輯技術(shù)，由tracr RNA、crRNA 和 Cas9三 種 成 分 構(gòu) 成［6］。將crRNA和tracrRNA組合為一條嵌合的引導(dǎo)序列RNA（sgRNA），從而進(jìn)一步簡(jiǎn)化為僅含sgRNA和Cas9這兩部分組成的新型系統(tǒng)，不需要在體外應(yīng)用RNaseⅢ切割DNA。sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別靶標(biāo)基因片段上的PAM序列，其中一段約20 bp的RNA序列可以和目標(biāo)基因序列特異互補(bǔ)配對(duì)，Cas9蛋白的Ruv C和HNH位點(diǎn)區(qū)域分別切割互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，再經(jīng)同源重組或非同源末端連接兩種修復(fù)途徑對(duì)發(fā)生斷裂的DNA雙鏈進(jìn)行修補(bǔ)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的定向精確編輯功能［10］。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在山羊和綿羊中的應(yīng)用

2.1 羊乳“人源化”改造

山羊乳成分更接近人乳，已成為牛奶的重要補(bǔ)充乳品，尤其適用于牛乳過(guò)敏癥體質(zhì)者。但是，羊乳中存在β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）等致敏原，能夠引起人體過(guò)敏反應(yīng)。羊乳的人源化改造是通過(guò)體細(xì)胞基因打靶技術(shù)，定點(diǎn)敲除基因的同時(shí)在山羊BLG基因座中敲入hα-LA或hLF等人營(yíng)養(yǎng)蛋白的功能基因，既可以去除山羊乳中的過(guò)敏原，又能增加羊乳中的營(yíng)養(yǎng)成分，從而提高羊乳的品質(zhì)，使其更適合于嬰幼兒飲用［11］。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)可提高BLG基因座定點(diǎn)敲除BLG或用人乳蛋白基因靶向?qū)氲男?，加快乳蛋白基因改造和羊乳“人源化”的研究的進(jìn)程。

2016年，劉暢［15］在山羊β-酪蛋白基因第二外顯子序列中設(shè)計(jì)了CRISPR/Cas9介導(dǎo)hfat-1基因打靶載體定點(diǎn)導(dǎo)入山羊胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選、PCR檢測(cè)后共獲得45株中靶細(xì)胞，打靶效率高達(dá)74.29%，明顯優(yōu)于TALENs介導(dǎo)的基因打靶，這為高效編輯羊乳蛋白基因和羊乳“人源化”改造提供了有力的研究?jī)r(jià)值。2017年，Zhou等［1］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地敲除奶山羊的BLG雙等位基因，為羊乳“人源化”改造的分子精準(zhǔn)遺傳育種提供了可能性；同年，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的張艷麗團(tuán)隊(duì)［16］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)人乳鐵蛋白在山羊BLG基因座的打靶研究，高效率地獲得了BLG-/hLF+基因打靶細(xì)胞株，該項(xiàng)研究主要是針對(duì)山羊BLG第一外顯子序列設(shè)計(jì)構(gòu)建了CRISPR/Cas9載體（pCas9-sg BLG）和BLG基因座的hLF基因打靶載體（p BHA-hLF-NIE），共轉(zhuǎn)染導(dǎo)入山羊耳成纖維細(xì)胞中，篩選檢測(cè)后，成功地獲得了大量的基因打靶細(xì)胞，打靶效率達(dá)到36.69%；值得一提的是，在這項(xiàng)研究中首次利用RAD51蛋白激活劑（RS-1）能夠顯著地提高外源基因敲入的效率，在今后的工作中值得借鑒。揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物基因工程實(shí)驗(yàn)室利用CRISPR/Cas9這把鋒刃的“利器”［17］，在奶山羊BLG基因座定點(diǎn)靶向敲入hLF基因，獲得了BLG基因座人乳鐵蛋白編碼序列定點(diǎn)整合山羊胎兒成纖維細(xì)胞系，并用于山羊體細(xì)胞克隆。該實(shí)驗(yàn)室針對(duì)山羊BLG基因第一外顯子序列構(gòu)建sgBLG/Cas9載體，電轉(zhuǎn)染導(dǎo)入山羊胎兒成纖維細(xì)胞，以中靶細(xì)胞作為體細(xì)胞核移植的供核細(xì)胞來(lái)制備轉(zhuǎn)基因山羊，移植受體母羊后，剖宮產(chǎn)獲得3只35日齡打靶克隆胎兒，經(jīng)鑒定為BLG-/hLF+基因型，并建立了細(xì)胞系，打靶效率高達(dá)51.4%，這為培育羊乳中富含功能營(yíng)養(yǎng)成分和低致敏原的轉(zhuǎn)基因山羊新品系提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

由于牛奶的巨大商業(yè)應(yīng)用和在乳品中的地位，也有學(xué)者提出對(duì)牛奶的人乳化改造。2015年，西北農(nóng)林科學(xué)大學(xué)張涌團(tuán)隊(duì)［18］首次通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)牛胎兒成纖維細(xì)胞β-酪蛋白基因進(jìn)行編輯，打靶效率為9.7%，這為牛β-酪蛋白基因座定點(diǎn)打靶hLF基因和改造動(dòng)物乳成分奠定了基礎(chǔ)，也為后續(xù)羊乳“人源化”改造提供了科學(xué)依據(jù)。阿根廷學(xué)者Alessio等［19］通過(guò)CRISPR/Cas9和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在牛的BLG基因座定點(diǎn)導(dǎo)入多不飽和脂肪酸（ω-3和ω-6）基因，有效地提高了人類(lèi)食用牛乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.2 提高羊肉品質(zhì)

肌肉生長(zhǎng)抑制素（Myostatin，MSTN）基因是一種骨骼肌生長(zhǎng)負(fù)調(diào)控基因，研究表明，哺乳動(dòng)物中的MSTN 可通過(guò)減少肌衛(wèi)星細(xì)胞的更新和肌纖維蛋白的合成，從而限制肌細(xì)胞的過(guò)度增長(zhǎng)，抑制動(dòng)物骨骼肌的生長(zhǎng)［20］。MSTN基因突變可導(dǎo)致動(dòng)物的成肌細(xì)胞數(shù)量增加，從而引起家畜的臀、肩、大腿等部位的肌肉群尤其發(fā)達(dá)而呈現(xiàn)“雙肌”性狀，這對(duì)于提高動(dòng)物產(chǎn)肉性能具有較高的應(yīng)用價(jià)值，一直是廣大育種科研者追求的目標(biāo)［12］。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因部分編碼序列或?qū)€(gè)另氨基酸的定點(diǎn)精準(zhǔn)突變，可以培育出MSTN-/-基因編輯動(dòng)物，由于該基因的變異而呈現(xiàn)“雙肌”表型，達(dá)到提高動(dòng)物瘦肉率、改善肉品質(zhì)的遺傳育種目標(biāo)。

2014年，連正興團(tuán)隊(duì)［21］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)綿羊的MSTN基因靶向修飾，通過(guò)胚胎顯微注射的方式成功獲得了2只MSTN基因突變羔羊，基因編輯的效率為5.7%，這是首例將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于綿羊MSTN基因編輯；同年，陳創(chuàng)夫等［22］首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于山羊MSTN基因的編輯，通過(guò)核移植的方式獲得了3只MSTN基因編輯山羊。2015年，Crispo等［12］根據(jù)綿羊的MSTN基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了CRISPR/Cas9表達(dá)載體，通過(guò)受精卵胞質(zhì)顯微注射的方式獲得了22只新生綿羊，經(jīng)鑒定有10只為MSTN基因突變綿羊，對(duì)其性狀進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因編輯綿羊的體重明顯大于野生型綿羊，表現(xiàn)出典型的“雙肌”表型性狀；進(jìn)一步研究分析，其中有8只為MSTN雙等位基因突變羔羊（含5只雜合子），這一研究證實(shí)了CRISPR/Cas9可在綿羊上高效敲除MSTN基因，是一種行之有效的基因編輯工具。此后，關(guān)于山羊和綿羊的MSTN基因敲除研究不斷涌現(xiàn)。2016年，Wang等［23］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)獲得了MSTN基因編輯綿羊，通過(guò)組織切片技術(shù)對(duì)MSTN基因突變綿羊和野生型綿羊的肌肉組織對(duì)比分析顯示，MSTN基因敲除能促進(jìn)綿羊的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育，其肌肉發(fā)育程度、肌纖維長(zhǎng)度均明顯高于普通野生型綿羊。2018年，于鴻浩等［24］和魏海霞等［20］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)分別獲得了MSTN基因突變山羊和綿羊，且突變效率得到了大大的提高，甚至高達(dá)100%編輯效率。Aiello和Patel等［25］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)MSTN基因突變也大大地促進(jìn)了羊肉品質(zhì)的提高。揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物基因工程實(shí)驗(yàn)室于寶利和梅珺琰等［26-27］根據(jù)山羊MSTN基因外顯子Ⅲ設(shè)計(jì)了sgRNA序列，并通過(guò)受精卵顯微注射的方式成功獲得2只MSTN基因突變山羊。經(jīng)測(cè)序比對(duì)，一只山羊?yàn)殡s合子雙等位基因突變（一條MSTN基因缺失12 bp，同時(shí)替換1 bp；另一條MSTN基因缺失3 bp），而另一只山羊則為單等位基因突變，僅一條MSTN基因缺失26 bp。兩只MSTN基因突變山羊胎兒均呈現(xiàn)明顯的“雙肌”表型，體重和體長(zhǎng)顯著增加，組織切片顯示肌束橫截面及肌纖維密度均顯著增大。

2.3 改善羊毛纖維品質(zhì)

隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)羊絨等動(dòng)物纖維服飾產(chǎn)品的需求也越來(lái)越大。絨山羊?qū)儆诋愘|(zhì)毛被，含有初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊兩種，其中次級(jí)毛囊生成的毛纖維便是羊絨，屬于無(wú)髓毛，而初級(jí)毛囊生成的則是有髓的粗毛［28］。研究發(fā)現(xiàn)，具有調(diào)控毛發(fā)生長(zhǎng)功能的基因主要有成纖維生長(zhǎng)因子（Fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial cell growth factor，VEGF）兩種，F(xiàn)GF5基因變異或VEGF基因轉(zhuǎn)入可導(dǎo)致毛囊生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，從而提高羊絨產(chǎn)量、改善絨品質(zhì)［28-30］。因此，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)絨山羊的FGF5和VEGF基因進(jìn)行定向精準(zhǔn)編輯，在絨山羊體內(nèi)突變FGF5基因和導(dǎo)入VEGF基因?qū)⑹翘岣呓q山羊產(chǎn)絨量和改善絨毛品質(zhì)的一種有效的精準(zhǔn)分子育種途徑。

2015 年，Wang 等［23］通過(guò) CRISPR/Cas9 系統(tǒng)胚胎注射獲得了21只FGF5靶向編輯的陜北白絨山羊，對(duì)獲得的FGF5編輯羊 0-120 d 的絨長(zhǎng)性狀檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)GF5基因靶向編輯的絨山羊的絨毛長(zhǎng)度和密度等指標(biāo)顯著高于野生型絨山羊，但此時(shí)獲得的FGF5基因編輯絨山羊存在脫靶效應(yīng)。2016年，西北農(nóng)林科技大學(xué)王小龍、陳玉林課題組［29］在絨山羊的毛囊特異性啟動(dòng)子KAP6.1的3'UTR非編碼區(qū)域設(shè)計(jì)sgRNA引導(dǎo)序列并構(gòu)建CRISPR/Cas9載體，與VEGF基因打靶載體共轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，結(jié)果表明sgRNA與Cas9介導(dǎo)VEGF定點(diǎn)敲入效率為15.7%-27.6%，外源VEGF基因有表達(dá)功能，且不影響原KAP6.1基因的正常表達(dá)，這為后期制備高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因絨山羊奠定了基礎(chǔ)。2017年，Hu等［3］和Li等［13］也應(yīng)用類(lèi)似的方法分別獲得了FGF基因敲除轉(zhuǎn)基因綿羊個(gè)體，進(jìn)一步加快了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在絨山羊基因組中編輯修飾的進(jìn)程。此外，內(nèi)蒙古大學(xué)劉東軍團(tuán)隊(duì)［30-31］利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)于2018年成功地制備了VEGF基因在FGF5和CCR5基因座定點(diǎn)打靶羔羊，在導(dǎo)入促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)基因的同時(shí)敲除沉默部分不利基因，這為培育產(chǎn)絨量高、品質(zhì)好的絨山羊新品種提供了科學(xué)依據(jù)，在改良毛發(fā)基因分子遺傳育種上起到了一舉兩得的作用。

2.4 其它相關(guān)性狀基因的挖掘和應(yīng)用

由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在動(dòng)物基因組編輯中顯示的巨大優(yōu)勢(shì)，育種工作者已將重點(diǎn)鎖定在與動(dòng)物表型相關(guān)的功能基因選擇作為基因編輯的目標(biāo)，培育出優(yōu)良性狀的新品種，適應(yīng)市場(chǎng)需求。目前在綿羊和山羊中已挖掘出了一大批表型相關(guān)基因［24］，主要有高原適應(yīng)相關(guān)基因（P53、EPAS1、IFNGR2、MAPK4、NOX4、SLC2A4、PDK1、SOCS2）、毛纖維性狀相關(guān)基因（FGF5、VEGF、Tβ4、PRL、LCE7A、MOGAT2、MOGAT3、ASIP）、產(chǎn)奶性狀相關(guān)基因（Casein、α-Lactalbumin、β-Lactoglobulin、ACACA、SCD、LPL、DGAT1、SSCP、gGH、SATA5A）、 沙漠 干 旱 適 應(yīng) 相 關(guān) 基 因（GPX3、ANAX6、GPX7、PTGS2、CPA3、ECE1）、繁殖和生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因（BMP15、GDF9、LTBP-1、BMPR1B、B4GALNT2、INHBA、MTNR1B、MSTN）、角型相關(guān)基因（RXFP2）、瘤胃功能相關(guān)基因（TCHHL2、PRD-SPRRII）等。通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)這些相關(guān)基因精準(zhǔn)編輯來(lái)制備和選育多種性狀優(yōu)良的動(dòng)物，是羊基因編輯分子育種潛在的研究熱點(diǎn)。

劉明軍團(tuán)隊(duì)［14］利用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功獲得了6只ASIP基因編輯綿羊的研究表明，該基因可作為綿羊毛色篩選的標(biāo)記基因。Niu等［32］應(yīng)用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)綿羊和灘羊的ASIP、BCO2和GDF9基因進(jìn)行編輯的研究，成功地獲得了有表型的基因編輯動(dòng)物個(gè)體。內(nèi)蒙古大學(xué)郝斐［33］通過(guò)CRISPR-Cas9系統(tǒng)和體細(xì)胞核移植技術(shù)制備了EDAR基因打靶絨山羊，觀察結(jié)果顯示EDAR基因打靶絨山羊出現(xiàn)頭頂沒(méi)有毛發(fā)、皮膚和毛囊異常等特征。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)郭日紅等［34］首次利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)敲除山羊CLPG1基因保守位點(diǎn)來(lái)研究“美臀”現(xiàn)象，為今后該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，還有Wu等［35］關(guān)于Rosa26基因的研究、Zhang等［36］關(guān)于fat-1基因的研究和Li等［37］關(guān)于Tβ4基因的研究，這些大量的相關(guān)基因研究為人們培育優(yōu)良性能的羊及其它動(dòng)物的奠定了基礎(chǔ)，也為基因編輯分子精準(zhǔn)遺傳育種提供了可靠的保障。

3 展望

基因編輯技術(shù)使人類(lèi)可以對(duì)生物體基因組進(jìn)行精準(zhǔn)的編輯（插入、缺失、突變等），從而定向改變其性狀。CRISPR/Cas9系統(tǒng)自問(wèn)世以來(lái)，就有著其它傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)學(xué)和遺傳育種領(lǐng)域創(chuàng)造了一批批科研奇跡，更被認(rèn)為是生物體中最有效、最便捷的基因編輯“利器”［38］。羊是一種重要的經(jīng)濟(jì)家畜動(dòng)物，也是一種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。研究羊的基因編輯對(duì)生物制藥、基因治療、物種性狀改良等領(lǐng)域具有重要意義。

此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在羊基因組編輯的其它方面也表現(xiàn)出較大的應(yīng)用前景。在遺傳育種中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)避免了傳統(tǒng)育種技術(shù)的種間生殖隔離、不良基因連鎖以及多代雜交、不可精準(zhǔn)控制等局限，可根據(jù)需求輕易引入新的優(yōu)良性狀基因，加快育種進(jìn)程［24］；在基因組學(xué)研究中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對(duì)各種基因組序列進(jìn)行精準(zhǔn)的編輯修飾，研究多個(gè)基因的協(xié)同作用或代償作用，構(gòu)建關(guān)鍵基因文庫(kù)，使功能基因的研究更加簡(jiǎn)單有效［32］；在疾病動(dòng)物模型中，通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了各種白化病、血友病、帕金森綜合癥、肺癌、糖尿病、心臟病、精神分裂癥以及器官移植相關(guān)基因的其它動(dòng)物模型［39］，這為今后開(kāi)展羊的相關(guān)疾病模型提供了有效途徑；在疫病防控中，通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可對(duì)羊炭疽病、羊結(jié)核病、羊痘等內(nèi)源致病相關(guān)基因進(jìn)行精準(zhǔn)改造，從而預(yù)防該疾病的發(fā)生；同時(shí)，通過(guò)基因編輯技術(shù)還可以對(duì)外源致病細(xì)菌或病毒的靶基因進(jìn)行切割滅活，從而殺滅該細(xì)菌和病毒以治療某些傳染性疾?。?0］。

目前雖然在羊乳“人源化”改造、提高肉品質(zhì)和改善毛纖維品質(zhì)等方面取得了一定的成果，但是，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在羊的基因編輯研究中還存在一定的局限性。例如，如何避免脫靶效應(yīng)和嵌合體突變動(dòng)物的產(chǎn)生；如何提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體的存活率和健康成長(zhǎng)率；如何確保轉(zhuǎn)基因遺傳育種及轉(zhuǎn)基因副產(chǎn)品的生物安全；如何縮短研發(fā)階段與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的差距等。因此，這些羊基因編輯相關(guān)問(wèn)題今后有必要進(jìn)一步研究，掃清障礙。

綜上所述，由于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)具有編輯效率高、構(gòu)建簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、精準(zhǔn)性高以及序列要求低等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，深受人們的信賴(lài)，為羊及其它動(dòng)物的遺傳育種、基因組學(xué)研究、疾病動(dòng)物模型和疫病防控等方面提供了新的方法和思路。同時(shí)，應(yīng)加大研發(fā)投入，充分發(fā)揮CRISPR/Cas9系統(tǒng)的巨大潛能，不斷優(yōu)化，爭(zhēng)取獲得更多振奮人心的研究成果，向產(chǎn)業(yè)化和市場(chǎng)化進(jìn)軍，推動(dòng)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。