葉明旺 李燦輝 龔明

（1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2. 云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院 云南省高校馬鈴薯生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界上最重要的塊莖類糧食作物，其在單位土地和時(shí)間內(nèi)所提供的糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)以及維生素超過了其他任何作物［1］。除了可以鮮食之外，馬鈴薯還可以通過工業(yè)加工成許多商品，如薯片、酒精、淀粉、動(dòng)物飼料等［2-3］。由于馬鈴薯栽培種絕大多數(shù)為四倍體，常規(guī)育種方法周期漫長，費(fèi)時(shí)費(fèi)工。盡管傳統(tǒng)育種方法已經(jīng)成功育成了許多品種，但是絕大多數(shù)馬鈴薯栽培種是高度雜合的同源四倍體，要想將有益突變集中到一個(gè)品種當(dāng)中相當(dāng)困難，通常育成一個(gè)成熟的品種需要十幾年的時(shí)間［4］。然而，隨著全球氣候變化、新病原體的出現(xiàn)以及提高馬鈴薯品質(zhì)、儲(chǔ)藏性、抗逆性等的需要，要求培育出具有理想農(nóng)藝性狀的馬鈴薯新品種。目前，通過多種分子輔助育種方法來進(jìn)行馬鈴薯性狀的改良，進(jìn)而提高產(chǎn)量、加工品質(zhì)以及儲(chǔ)藏品質(zhì)等方面已取得了一些進(jìn)展［5］。隨著馬鈴薯的基因組測(cè)序完成［6］，以及基因組編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，使得馬鈴薯的育種改良進(jìn)程得以加快，定向設(shè)計(jì)和精準(zhǔn)分子育種成為可能。本課題組在2018年通過CRISPR/Cas9基因組編輯體系對(duì)自交不親和的二倍體馬鈴薯S-RNase基因進(jìn)行了編輯敲除，成功獲得了自交親和的二倍體馬鈴薯突變材料，為后續(xù)的二倍體馬鈴薯雜交育種體系建立奠定了重要的基礎(chǔ)［7］。本文簡(jiǎn)要綜述了3類主流基因組編輯技術(shù)的原理，回顧了基因組編輯技術(shù)在馬鈴薯品種改良和精準(zhǔn)分子育種中的應(yīng)用，討論了基因組編輯技術(shù)對(duì)于馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種的意義和目前存在的問題，并對(duì)基因組編輯技術(shù)在馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種中的應(yīng)用進(jìn)行了展望，旨在為該技術(shù)在以后的馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種中的應(yīng)用提供借鑒和新思路。

1 基因組編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)是通過位點(diǎn)特異性核酸酶（Site-specific nucleases，SSNs）對(duì)靶位點(diǎn)造成DNA的雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSBs），從而引發(fā)機(jī)體的修復(fù)機(jī)制，修復(fù)機(jī)制包括兩種：非同源末端連接和同源重組修復(fù)［8］。非同源末端連接是一種高效的修復(fù)方式，能夠快速在斷口完成修復(fù)，但是重復(fù)的修復(fù)會(huì)引入錯(cuò)配，導(dǎo)致斷裂位點(diǎn)產(chǎn)生缺失或者插入突變；這些突變使得基因的閱讀框發(fā)生了變化，進(jìn)而翻譯出無功能或功能變異的蛋白，從而達(dá)到敲除該基因的目的。同源重組修復(fù)指的是斷裂位點(diǎn)在修復(fù)的時(shí)候直接以轉(zhuǎn)入細(xì)胞的與斷裂位點(diǎn)同源的外源片段作為修復(fù)模板，使得在斷口位置插入特定的基因或片段［9］。在此基礎(chǔ)上，人們可以對(duì)任何已知序列的基因進(jìn)行敲除以研究其功能，同時(shí)也可以對(duì)目的基因進(jìn)行定點(diǎn)修復(fù)，使之恢復(fù)或者替換基因功能。目前主要用于基因組編輯的有3種SSNs：鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs） 以 及 RNA 介 導(dǎo) 的 規(guī)律的成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9，CRISPR/Cas9）。

1.1 ZFNs

ZFNs是由人工合成的核酸酶，包括了兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)是由多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)能結(jié)合3 bp的DNA序列［10-11］；另一個(gè)是由非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ組成的DNA斷裂結(jié)構(gòu)域［12］。FokⅠ需要以二聚體的形式才能夠行使斷裂功能［13］，因此需要在靶點(diǎn)兩端單獨(dú)設(shè)計(jì)ZFN，使與之相連的FokⅠ核酸酶能夠在靶點(diǎn)聚集，增加形成二聚體的概率，完成切割DNA雙鏈并引發(fā)細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制。

早在2001年，Bibikova等［14］就通過人工合成的ZFNs和外源質(zhì)粒注射到非洲蟾蜍的卵母細(xì)胞中，成功獲得了經(jīng)過切割修復(fù)的質(zhì)粒。隨后，Bibikova等［15］又在果蠅中實(shí)現(xiàn)了對(duì)Y（yellow）基因進(jìn)行定向突變，催生了ZFNs在基因組編輯中的應(yīng)用。ZFNs已被報(bào)道應(yīng)用于一些植物基因組編輯當(dāng)中，如擬南芥［16］、玉米［17］、大豆［18］等，但未見到以馬鈴薯為材料的報(bào)道。

雖然ZFNs能夠大大提高基因的編輯效率，但是由于公開的鋅指模塊較少，構(gòu)建一個(gè)能夠識(shí)別特定靶位點(diǎn)的ZFNs需要通過大量的篩選獲得能夠特異結(jié)合靶位點(diǎn)的鋅指蛋白。此外，ZFNs對(duì)細(xì)胞的毒性也限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用［19］。

1.2 TALENs

人工改造的TALENs和ZFNs原理相似，其斷裂結(jié)構(gòu)域同樣由非特異性核酸內(nèi)切酶FokⅠ組成；其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是黃單胞菌入侵植物時(shí)所分泌的轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物［20］（Transcription activator-like effector，TALEs）。TALEs能夠進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合特定的DNA序列，激活部分基因的表達(dá)，增加植物對(duì)病毒的敏感性，也有可能引發(fā)植物防御機(jī)制。TALEs是由多個(gè)33-35個(gè)氨基酸組成的串聯(lián)重復(fù)序列組成，每個(gè)重復(fù)大部分氨基酸的序列是不變的，只有在12/13位的氨基酸（重復(fù)可變雙殘基，Repeat-variable diresidues，RVDs）是可變的。含有不同RVDs的重復(fù)序列能夠一對(duì)一的識(shí)別不同的堿基，利用特定的TALEs模塊組合，能夠?qū)崿F(xiàn)識(shí)別任何DNA序列的目的。連接在TALEs上的核酸酶FokⅠ在局部形成二聚體，就能在靶位點(diǎn)進(jìn)行精確DSBs，實(shí)現(xiàn)基因組編輯的目的［21-22］。相對(duì)ZFNs來說，TALENs省去了大規(guī)模篩選鋅指結(jié)構(gòu)的程序，加大了靶向任何序列的能力，但是實(shí)現(xiàn)TALENs模塊的組裝比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，影響了該技術(shù)的大規(guī)模推廣。

自2010年以來，TALENs在酵母中完成了對(duì)外源質(zhì)粒的DSBs以及同源重組修復(fù)后，該技術(shù)已經(jīng)在一些農(nóng)作物上進(jìn)行了應(yīng)用，如煙草［23］、大豆［24］等。TALENs在馬鈴薯中也有幾個(gè)成功的例子，2015年，Nicolia等［25］建立了馬鈴薯原生質(zhì)體的基因組編輯體系，其編輯效率達(dá)到了10%。同樣，TALENs介導(dǎo)的同源重組修復(fù)在馬鈴薯中也成功實(shí)現(xiàn)，Butler等［26］2016年通過雙生病毒提供了大量的修復(fù)模板，成功提高了在馬鈴薯中的同源重組效率。

1.3 CRISPR/Cas9

早在1987年，日本科學(xué)家Ishino等［27］在研究大腸桿菌的iap基因的時(shí)候，在其側(cè)翼發(fā)現(xiàn)了一連串由29個(gè)堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列，其間由32個(gè)特異堿基間隔開。在之后的研究中發(fā)現(xiàn)，這類結(jié)構(gòu)存在于許多的原核生物中［28］。這種結(jié)構(gòu)在2002年被正式命名為CRISPR，其間的間隔特異序列被稱之為Spacer。2005年，Bolotin［29］通過比較嗜熱鏈球菌的CRISPR序列和噬菌體的基因組時(shí)發(fā)現(xiàn)，噬菌體的序列與Spacer的序列是部分匹配的，同時(shí)證實(shí)了CRISPR系統(tǒng)與嗜熱鏈球菌抵抗病毒相關(guān)?？茖W(xué)家們?cè)趯?duì)CRISPR的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可以掃描噬菌體中在序列3’端含有NGG也就是PAM序列的DNA序列并進(jìn)行切割，然后整合到細(xì)菌自身的CRISPR序列當(dāng)中，形成新的Spacer；當(dāng)噬菌體再次入侵的時(shí)候，CRISPR序列轉(zhuǎn)錄成CRISPR RNA，經(jīng)加工成熟后與Cas蛋白結(jié)合，引導(dǎo)Cas蛋白切割與之匹配的噬菌體DNA序列，達(dá)到防御的目的。

CRISPR根據(jù)基因的保守性和組織排列特異性分為3種類型：I型和III型需要6到7種蛋白質(zhì)才能發(fā)揮作用，目前通常用的是II型的CRISPR，只需要一種Cas9蛋白就能發(fā)揮作用［30］。2012年，Jinek等［31］首先構(gòu)建了CRISPR/Cas9載體，完成了環(huán)狀DNA以及線性化DNA的體外切割。該系統(tǒng)主要含有兩部分：Cas9蛋白以及導(dǎo)向靶基因的單鏈引導(dǎo)RNA（Single guide RNA，sgRNA）。因?yàn)闈撛诘陌悬c(diǎn)很多，以及載體構(gòu)建方便，CRISPR/Cas9系統(tǒng)開始大規(guī)模應(yīng)用于各種生物的研究。

目前，CRIPSR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種植物基因組編輯上［32］。在馬鈴薯中，Butler 等［33］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)分別對(duì)二倍體和四倍體馬鈴薯的乙酰乳酸合成酶基因（Acetolactate synthase1，StALS1）進(jìn)行了敲除，其中突變效率最高達(dá)到了60%。Hiroaki等［34］利用水稻的OsMac3的翻譯增強(qiáng)子插入到啟動(dòng)子和Cas9基因之間，能夠明顯增加馬鈴薯等位基因的突變效率。Nadakuduti等［35］還對(duì)比了CRISPR/Cas9和TALENs在馬鈴薯原生質(zhì)體中的突變效率，研究表明Cas9的編輯效率（27.4%）明顯高于TALENs的編輯效率（12.6%）。另外，Veillet等［36］通過胞嘧啶單堿基核苷酸編輯使StALS1突變，使馬鈴薯獲得了除草劑抗性，結(jié)合農(nóng)桿菌侵染方法，從而獲得不含外源DNA片段的基因組編輯植株。

2 基因組編輯在馬鈴薯品種改良和精準(zhǔn)分子育種中的應(yīng)用

2.1 降低馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿含量

糖苷生物堿（Steroidal glycoalkaloids，SGAs）是一種存在于馬鈴薯中的有毒物質(zhì)［37］，是影響馬鈴薯品質(zhì)的重要性狀。在馬鈴薯育種過程中，通過與野生種馬鈴薯雜交，能夠帶來一些優(yōu)異的抗病性狀，但同時(shí)也會(huì)提高SGAs的含量［38］，所以控制SGAs的含量對(duì)于馬鈴薯育種來說是非常重要的。

甾醇側(cè)鏈還原酶2（SSR2）是合成膽固醇的關(guān)鍵酶，與SGAs的合成密切相關(guān)。Sawai等［39］首先通過RNAi技術(shù)對(duì)馬鈴薯的StSSR2進(jìn)行干涉，在StSSR2轉(zhuǎn)錄本顯著降低的轉(zhuǎn)基因植株中，SGAs的含量無論在試管苗或是塊莖皮中都低于非轉(zhuǎn)基因的10%以下，且膽固醇的含量也顯著降低。同時(shí)，下調(diào)StSSR2的表達(dá)量并不會(huì)影響薯塊的產(chǎn)量。然后通過TALENs載體在StSSR2上引入突變，獲得的突變體中SGAs的含量同樣下降到野生型的10%左右。利用這種人工創(chuàng)制的低SGAs的馬鈴薯材料，能夠加速低SGAs品種定向改良及精準(zhǔn)育種的進(jìn)程。此外，在龍葵堿合成通路中，還有一個(gè)2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶（2-oxoglutaratedependent dioxygenase，16DOX）基因，在RNAi植株中被證實(shí)能夠強(qiáng)烈抑制SGAs的產(chǎn)生［40］，同時(shí)不會(huì)影響馬鈴薯的產(chǎn)量。隨后，Nakayasu等［41］利用CRISPR/Cas9基因組編輯體系在馬鈴薯根中對(duì)St16DOX進(jìn)行了敲除，之后對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在St16DOX不能正常表達(dá)的植株當(dāng)中SGAs的含量幾乎為零。因此，St16DOX能夠成為創(chuàng)制不含SGAs的馬鈴薯品種潛在的基因組編輯位點(diǎn)。顯然，經(jīng)過多組學(xué)手段，進(jìn)一步弄清馬鈴薯SGAs的詳細(xì)代謝途徑及關(guān)鍵調(diào)控酶基因，而后通過基因組編輯技術(shù)，可為降低馬鈴薯塊莖SGAs含量的精準(zhǔn)分子育種提供一條強(qiáng)有力而快捷的技術(shù)實(shí)現(xiàn)途徑。

2.2 改良低溫儲(chǔ)藏馬鈴薯塊莖的品質(zhì)

為了延長馬鈴薯的儲(chǔ)藏時(shí)間，生產(chǎn)上一般都會(huì)采取冷藏的方式，但是冷藏會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯的蔗糖大量裂解產(chǎn)生還原糖，使得馬鈴薯在高溫加工時(shí)產(chǎn)生黑色苦味產(chǎn)物，降低品質(zhì)［42-44］。還原糖還能夠與游離氨基酸如天冬酰胺反應(yīng)生成致癌物質(zhì)丙烯酰胺［45］。所以在冷藏馬鈴薯中，還原糖的含量是一個(gè)很重要的指標(biāo)。

液泡轉(zhuǎn)化酶（VInv）定位在液泡中，在低溫冷藏馬鈴薯產(chǎn)生還原糖中扮演著重要的角色［46］，通過RNAi下調(diào)StVlnv的表達(dá)能夠顯著降低薯塊中的還原糖濃度，使得薯片中丙烯酰胺的含量下降到野生型薯片的1/15。之后，Clasen等［47］通過PEG介導(dǎo)，把包含靶向StVlnv的TALENs載體導(dǎo)入馬鈴薯原生質(zhì)體中，成功獲得了StVlnv敲除的再生植株。在4個(gè)等位基因都突變的冷藏馬鈴薯當(dāng)中，葡萄糖和果糖的含量低于該實(shí)驗(yàn)的極限檢測(cè)值（＜0.1 mg/g），同時(shí)蔗糖的含量明顯上升。在StVlnv敲除的冷藏馬鈴薯加工成薯片之后，其中丙烯酰胺的含量相較于野生型的下降了73.3%，且薯片的顏色明顯要優(yōu)于野生型的薯片。這為解決冷藏馬鈴薯的品質(zhì)變差提供了很好的解決方法。

2.3 修改馬鈴薯塊莖中的淀粉組成成分

馬鈴薯淀粉在食品和工業(yè)上都有著非常廣泛的應(yīng)用。通常可以通過化學(xué)或者物理的方式來改變淀粉的性質(zhì)，但是這些手段或多或少都會(huì)影響環(huán)境［48］。所以，如果在馬鈴薯塊莖中能夠直接完成淀粉合成特性的轉(zhuǎn)變將會(huì)非常有應(yīng)用價(jià)值。淀粉有兩種組成成分：直鏈淀粉和支鏈淀粉。其中，馬鈴薯中含有一個(gè)合成直鏈淀粉關(guān)鍵的酶：顆粒結(jié)合淀粉合成酶（GBSS1）。高支鏈淀粉馬鈴薯（蠟質(zhì)馬鈴薯）已經(jīng)通過RNAi技術(shù)干涉StGBSS1成功實(shí)現(xiàn)［49］。隨后，Andersson等［50］通過在四倍體馬鈴薯中瞬時(shí)表達(dá)靶向StGBSS1的CRISPR/Cas9編輯載體，使得該基因的4個(gè)等位基因全部突變，實(shí)現(xiàn)了馬鈴薯中合成的淀粉全部成為支鏈淀粉，并且沒有任何外源DNA片段插入馬鈴薯基因組的情況，這為定向改變馬鈴薯塊莖中的淀粉組成成分，進(jìn)而為特定食品和工業(yè)用途的馬鈴薯品種的精準(zhǔn)分子育種提供了一個(gè)很好的范例。

2.4 改變馬鈴薯自交不親和性

目前，栽培種馬鈴薯都是四倍體，一個(gè)馬鈴薯品種要育成每個(gè)顯性抗病基因存在3個(gè)或者4個(gè)等位基因的話，可能需要時(shí)間長達(dá)15年［51］，這對(duì)于馬鈴薯的品種改良是很不利的。而如果用二倍體馬鈴薯的的近交系進(jìn)行雜交育種的話可能是一個(gè)高效的育種方式［4，52］。但是二倍體馬鈴薯存在著自交不親和（Self-incompatibility，SI）現(xiàn)象。馬鈴薯中，自交不親和由高多態(tài)性的S位點(diǎn)所控制，在野生馬鈴薯Solanum chacoense中含有顯性的S位點(diǎn)抑制基因（Sli），能夠?qū)崿F(xiàn)馬鈴薯的自交［53］。但是，導(dǎo)入該基因會(huì)使得S. chacoense中的一系列未馴化位點(diǎn)，如長匍匐莖、高龍葵堿等帶入到育種材料中，增加篩選的工作量［38，54］。本課題組在2018年，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了控制二倍體馬鈴薯自交不親和的雌蕊決定基因S-RNase序列全長，之后通過CRISPR/Cas9基因組編輯體系，對(duì)該基因進(jìn)行了編輯，成功獲得了S-RNase雙等位基因突變的且自交親和的二倍體馬鈴薯材料［7］。該研究開辟了二倍體馬鈴薯育種的新途徑，拓展了自交親和馬鈴薯資源，將加速馬鈴薯的遺傳改良［55］。不久之后，Enciso-Rodriguez等［56］也對(duì)S-RNase進(jìn)行敲除，同樣獲得了能夠自交親和的二倍體馬鈴薯，進(jìn)一步證實(shí)了對(duì)S-RNase的編輯能夠獲得自交親和的二倍體馬鈴薯材料。

3 展望

基因組編輯技術(shù)效率高，可對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除、插入、替換等，是非常實(shí)用的基因功能研究以及精準(zhǔn)分子育種工具，已成為農(nóng)作物改良的重要技術(shù)。目前基因組編輯技術(shù)在重要農(nóng)作物如水稻、小麥、玉米等基因功能驗(yàn)證及定向遺傳改良方面已有許多成功的案例，但是在馬鈴薯定向遺傳改良方面的成功運(yùn)用尚還有限。

馬鈴薯栽培品種通常是高度雜合的同源四倍體，遺傳背景復(fù)雜，涉及到產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等許多重要農(nóng)藝性狀的重要代謝途徑和關(guān)鍵控制基因尚不清楚，進(jìn)而或?yàn)橥ㄟ^基因組編輯來進(jìn)行馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種的核心限制因素。因此，通過多組學(xué)聯(lián)合分析，弄清控制馬鈴薯重要農(nóng)藝性狀的代謝途徑和闡明關(guān)鍵控制基因的功能，將會(huì)為基因組編輯技術(shù)運(yùn)用于馬鈴薯精準(zhǔn)分子育種奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

此外，基因組編輯技術(shù)用于改良重要農(nóng)作物對(duì)生物和非生物脅迫抗性已有不少成功的案例［57-58］，但在馬鈴薯方面尚未見到報(bào)道。馬鈴薯晚疫病是公認(rèn)的對(duì)馬鈴薯最嚴(yán)重的病害，能夠在感染后10 d完全摧毀馬鈴薯植株［59］。Oliva等［60］在水稻上已經(jīng)通過基因組編輯技術(shù)編輯了感病基因（Susceptible gene）SWEET11、SWEET 13和SWEET 14的啟動(dòng)子的EBE結(jié)合元件，進(jìn)而提高了水稻對(duì)細(xì)菌性白葉枯病廣泛的抵抗力。而在馬鈴薯上同樣存在著許多S基因，如StUBK［61］、StBSL家族基因［62］和StVIK［63］等，沉默這些基因能夠獲得抗病性增強(qiáng)的表型?？梢酝茰y(cè)，利用基因組編輯技術(shù)能夠使得這些S基因應(yīng)用于馬鈴薯抗晚疫病的精準(zhǔn)分子育種，這將會(huì)是一個(gè)很有前景的研究方向。

因馬鈴薯品種的原因，很多品種的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系建立起來比較困難［64］，使得一部分品種的馬鈴薯難以獲得所需要的轉(zhuǎn)基因植株；此外，由于目前轉(zhuǎn)基因作物在公眾中的接受程度不高，想要推廣基因組編輯馬鈴薯最好在完成編輯的馬鈴薯中不含外源DNA片段。對(duì)于含有外源片段的基因組編輯植株來說，想要去除轉(zhuǎn)基因植株的外源片段，可以通過自交的方式進(jìn)行篩選［7，56］。另外，也可以通過載體在馬鈴薯原生質(zhì)體中瞬時(shí)編輯來達(dá)到不含外源DNA片段的目的。但是，馬鈴薯的原生質(zhì)體游離以及再生過程十分繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長達(dá)6-7個(gè)月［25］。因此，進(jìn)一步改良和完善基因組編輯技術(shù)，以獲得不含外源DNA片段的無轉(zhuǎn)基因且能穩(wěn)定遺傳的基因組編輯馬鈴薯品種，這將會(huì)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

CRISPR/Cas9基因組編輯體系因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且編輯效率高，在3種基因組編輯工具中應(yīng)用最為廣泛，但是其對(duì)于靶位點(diǎn)的識(shí)別可以容忍幾個(gè)堿基對(duì)的不匹配，這意味著某些靶位點(diǎn)可能存在著數(shù)千的潛在脫靶位點(diǎn)，所以會(huì)造成脫靶現(xiàn)象，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生遺傳損害作用［65-67］。Upadhyay等［68］通過對(duì)小麥的肌醇加氧酶基因（Inositol oxygenase，INOX），八氫番茄紅素基因（Phytoene desaturase，PDS）的靶位點(diǎn)進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)在gRNA的近5'部分不匹配并不會(huì)完全破壞Cas9的編輯效率。Xie等［69］通過對(duì)水稻的PS3基因進(jìn)行編輯時(shí)，對(duì)11個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)被成功編輯的潛在脫靶位點(diǎn)。這對(duì)于CRISPR/Cas9應(yīng)用于作物精準(zhǔn)分子育種是非常不利的。目前主要有3種降低脫靶率的方法：一是改變野生型的Cas9酶活性中心的關(guān)鍵催化殘基，使其由內(nèi)切酶轉(zhuǎn)化為切口酶，在靶位點(diǎn)使用兩個(gè)毗鄰的gRNA，能夠顯著的降低脫靶效應(yīng)且不損壞其編輯效率［70-71］；而在單堿基突變的體系當(dāng)中，Zhou等［72］通過把腺嘌呤編輯器（Adenine base editors7.10，ABE7.10）中的腺嘌呤脫氫酶148位的脯氨酸置換為精氨酸后，能夠完全去除對(duì)RNA的脫靶效應(yīng)，且并不會(huì)降低對(duì)靶位點(diǎn)DNA的編輯效率。二是通過在gRNA的5'縮短2-3 bp，同樣能夠降低脫靶效應(yīng)［73］。三是通過在線工具如（http：//cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/）來指導(dǎo)設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)，達(dá)到降低脫靶效應(yīng)的目的［74］。Xie等［75］對(duì)幾個(gè)重要的模式作物以及農(nóng)作物的全基因組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)含有特異性的gRNA的轉(zhuǎn)錄單元數(shù)量達(dá)到了83.4%-98.6%。因此，大部分基因都可以通過精心挑選靶位點(diǎn)，來避免脫靶效應(yīng)。另外，Cas9蛋白在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)表達(dá)也會(huì)對(duì)細(xì)胞造成持續(xù)的損傷，Jiang等［76］對(duì)萊茵衣藻進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白的持續(xù)表達(dá)能夠?qū)θR茵衣藻產(chǎn)生毒害作用。在人體細(xì)胞中，通過注射gRNA和Cas9蛋白可以顯著的降低Cas9蛋白對(duì)細(xì)胞造成的毒害作用［77］。目前，Cas9蛋白在馬鈴薯中的持續(xù)表達(dá)所造成的細(xì)胞毒害以及解決方法尚未見到報(bào)道。這就需要大量的實(shí)驗(yàn)來論證并克服Cas9蛋白對(duì)馬鈴薯的毒害作用，為基因組編輯技術(shù)應(yīng)用于馬鈴薯的精準(zhǔn)分子育種提供支撐。

總之，基因組編輯技術(shù)將會(huì)給馬鈴薯的精準(zhǔn)分子育種提供一個(gè)重要的技術(shù)解決手段，使馬鈴薯的重要農(nóng)藝性狀如低SGAs含量、營養(yǎng)與品質(zhì)、風(fēng)味、對(duì)生物和非生物脅迫的抗性等得以進(jìn)行精準(zhǔn)的定向遺傳改良。目前需要通過多組學(xué)手段，全面解析控制馬鈴薯重要農(nóng)藝性狀的代謝途徑和關(guān)鍵基因，進(jìn)一步開發(fā)精準(zhǔn)高效的基因組編輯技術(shù)，并與常規(guī)育種方法相結(jié)合，以最終育成更多性狀優(yōu)良的馬鈴薯品種。