時(shí)軍利 王 磊 李 萍 李炳慶 (承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，承德 067000)

結(jié)腸癌發(fā)病率居全球常見(jiàn)癌癥的第三位，且發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，其致死率高，在美國(guó)2017年就報(bào)告了新發(fā)病例135 430例，病死例數(shù)約為50 260例，我國(guó)2015年報(bào)告了350 000例新發(fā)病例和190 000例死亡病例[1]。目前對(duì)于結(jié)腸癌的治療主要是手術(shù)和化療，前者主要應(yīng)用于早期未發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例，雖然化療可以為根治術(shù)后的患者或者符合手術(shù)條件的患者帶來(lái)臨床獲益，但因化療副作用及化療耐受等因素，大部分患者并不能從中獲益[2]。故而，對(duì)于新的副作用小及安全有效的治療方案仍為研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。

吉非替尼(GEF)是可逆性小分子酪氨酸激酶抑制劑，可以競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶催化區(qū)域的Mg-ATP結(jié)合位點(diǎn)，從而起到抑制EGFR自身磷酸化的作用，并由此阻斷其下游信號(hào)分子的傳導(dǎo)，最終達(dá)到抑制腫瘤的作用[3]。吉非替尼在多種腫瘤中均有抑癌作用，如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌及卵巢癌等[4]，因?yàn)檫@些腫瘤中均有EGFR的異?；罨?，從而通過(guò)下游通路激活腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能[5]。但是，隨著吉非替尼的療程增加，患者逐漸出現(xiàn)對(duì)藥物的抵抗性，這可能是因?yàn)榻Y(jié)腸癌患者中缺乏具有活性的突變型EGFR[6]，所以需要進(jìn)一步進(jìn)行吉非替尼聯(lián)合其他藥物治療結(jié)腸癌患者的研究，這可以使患者從中獲益，尤其是那些已經(jīng)對(duì)吉非替尼產(chǎn)生耐藥性的患者，這顯得尤為重要。

作為中醫(yī)文化的起源地，中藥是我國(guó)乃至全球的寶貴財(cái)富，諸多中藥或者其提取物在抑癌治療上顯示了顯著的優(yōu)勢(shì)?？鄥A是豆科槐屬植物苦參的主要有效成分之一，有報(bào)道指出其具有調(diào)節(jié)血脂、增強(qiáng)免疫力、抗炎等功效，并不斷有研究證明其在諸多腫瘤上具有抗腫瘤作用，如宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌、肺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌及結(jié)腸癌等[7-11]。但是苦參堿聯(lián)合吉非替尼在結(jié)腸癌細(xì)胞的體內(nèi)、體外及臨床研究尚無(wú)報(bào)道，本研究旨在探究這兩種藥物是否起到協(xié)同或者相加的作用，從而為臨床治療結(jié)腸癌患者提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞培養(yǎng)基1640和高糖DMEM購(gòu)自美國(guó)Coring公司(1640批號(hào)10-040-CVR，DMEM批號(hào)10-013-CVR)；青鏈霉素雙抗購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)公司(貨號(hào)CA0075)；胎牛血清購(gòu)自 Gibco 公司(貨號(hào)10099-141)；培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、各種型號(hào)的槍頭、Transwell小室等常用耗材均購(gòu)自北京普京康利有限公司，甲醇、分離膠、濃縮膠、TBST等化學(xué)試劑購(gòu)自北京普利萊試劑公司；Vemintin(貨號(hào)D21H3)、SNAIL(貨號(hào)C15D3)、Cyclin D1 抗體(貨號(hào)92G2)、P-mTOR抗體(貨號(hào)D9C2)、mTOR抗體(貨號(hào)7C10)、Caspase-3抗體(貨號(hào)9662S)和 Bax抗體(貨號(hào)D2E11)均購(gòu)自美國(guó)CST公司； ECLPlμs化學(xué)發(fā)光試劑盒、HRP辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗及HRP辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗及細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)試劑盒(C1052)均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；PVDF(IPVH00010)轉(zhuǎn)印膜購(gòu)自密理博(Millipore)公司；亞甲基藍(lán)溶液購(gòu)自北京中生瑞泰科技公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京普利萊試劑公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)發(fā)展公司；用DMSO制備儲(chǔ)存濃度為5 mmol/L的吉非替尼(上海Selleck-Biotool公司)溶液；用1640或者DMEM配制儲(chǔ)存濃度為200 mg/ml的苦參堿(MA，Sigma公司)溶液。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞系：HCT116(細(xì)胞系從北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi))接種于含10%胎牛血清(Gibco，USA)和1%青鏈霉素的 RPMI1640(Coring，USA)培養(yǎng)液，于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；SW480和SW620(細(xì)胞系從北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi))用含10%胎牛血清(Gibco，USA)和1%青鏈霉素的 DMEM(Coring，USA)，于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 利用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行相關(guān)操作，將3種人結(jié)腸癌細(xì)胞系按照5 000個(gè)/孔細(xì)胞量進(jìn)行均勻鋪板后，在37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁完全后，用含0 μmol/L GEF+0 mg MA、16 mg/ml MA[12]、10 μmol/L GEF[13]、16 mg/ml MA+10 μmol/L GEF的血清培養(yǎng)液進(jìn)行換液培養(yǎng)，并于換液后的0 h、24 h、48 h、96 h后棄去培養(yǎng)液，代之以無(wú)血清培養(yǎng)基100 μl/孔，并加入CCK8試劑10 μl，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量OD值，并記錄數(shù)據(jù)。每個(gè)細(xì)胞系每組設(shè)置5塊板6個(gè)復(fù)孔，每天用一塊。

1.2.3細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn) 將3種細(xì)胞系以一定密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，生長(zhǎng)24～48 h后，待細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到70%～80%后，用200 μl槍頭輕輕地在細(xì)胞間進(jìn)行劃痕，劃痕縱穿整個(gè)培養(yǎng)孔，之后用培養(yǎng)基輕輕洗板2次，將脫落細(xì)胞洗去，隨后用含0 μmol/L GEF+0 mg MA、16 mg/ml MA、10 μmol/L GEF、16 mg/ml MA+10 μmol/L GEF的無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，并于 48 h后，用電子顯微鏡下拍照采圖，并用Image J軟件進(jìn)行測(cè)量并計(jì)算。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 在含有4 ml培養(yǎng)基的6孔板中接種5×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁完全之后，用16 mg/ml MA、10 μmol/L GEF、16 mg/ml MA+10 μmol/L GEF的血清培養(yǎng)液進(jìn)行換液培養(yǎng)14 d，無(wú)藥物組則不加任何藥物處理，中間視細(xì)胞狀態(tài)隨時(shí)更換新鮮的含藥培養(yǎng)基。14 d后待克隆團(tuán)形成之后用10%甲醛固定細(xì)胞，1%亞甲基藍(lán)染色，流水沖洗干凈晾干后在顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)(克隆數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的視為克隆團(tuán))并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 將3種細(xì)胞系以一定密度接種到60 mm細(xì)胞培養(yǎng)板中過(guò)夜培養(yǎng)，隨后將培養(yǎng)基更換為含0 μmol/L GEF+0 mg MA、16 mg/ml MA、10 μmol/L GEF、16 mg/ml MA+10 μmol/L GEF的血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后用胰酶收集細(xì)胞，固定于4℃過(guò)夜后，按照周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PI細(xì)胞染色，隨后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將3種細(xì)胞系以一定密度接種到60 mm細(xì)胞培養(yǎng)板中過(guò)夜培養(yǎng)，隨后將培養(yǎng)基更換為含0 μmol/L GEF+0 mg MA、16 mg/ml MA、10 μmol/L GEF、16 mg/ml MA+10 μmol/L GEF的血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后用胰酶收集細(xì)胞于離心管中，加入Binding buffer與FITC標(biāo)記的Annexin-V 室溫避光30 min，再加入PI避光孵育5 min，隨后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7Western blot Western blot方法檢測(cè)Caspase-3、Bax、Vemintin、SNAIL、Cyclin D1、P-AMPK、AMPK、P-mTOR和mTOR等蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同組別的藥物處理24 h后，用含蛋白酶抑制劑的RIPA buffer裂解液，進(jìn)行蛋白質(zhì)的裂解及收集，用BCA蛋白定量劑盒對(duì)所提取的蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行測(cè)定。各組取30 μg蛋白總量進(jìn)行上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳將其分離后，經(jīng)電轉(zhuǎn)(半干轉(zhuǎn)或者濕轉(zhuǎn))操作將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟PVDF上，隨后進(jìn)行封閉(室溫?fù)u晃1～2 h)，一抗4℃過(guò)夜孵育，二抗常溫孵育2 h后，根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(上海天能)中對(duì)PVDF膜上的蛋白印跡進(jìn)行曝光顯色，并進(jìn)行拍照保存圖片。

2 結(jié)果

2.1聯(lián)合用藥對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖抑制作用 單一使用MA或者GEF均可以顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖能力(P<0.05)，二者聯(lián)用之后，對(duì)增殖能力的抑制作用較單一用藥組更為顯著，且表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明聯(lián)合用藥可以顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖。見(jiàn)圖1及表1～3。

2.2聯(lián)合用藥對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系克隆形成的影響 與空白組比較，單用MA或者單用GEF組，人結(jié)腸癌細(xì)胞系的克隆形成能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與單用GEF或者M(jìn)A組比較聯(lián)合組人結(jié)腸癌細(xì)胞系克隆形成能力下降得更為明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表4。

圖1 經(jīng)過(guò)各組藥物處理之后的人結(jié)腸癌細(xì)胞系增殖能力變化

2.3聯(lián)合用藥對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系周期的影響 與空白組比較，單用MA或單用GEF，均可以誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞系的細(xì)胞周期不同程度阻滯在G0/G1期；二者聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞G0/G1期阻滯更為顯著；見(jiàn)圖3、表5。

GroupsOD0 h24 h48 h96 h120 hCtrl0.35±0.020.48±0.051.37±0.131.76±0.092.31±0.10MA0.34±0.080.40±0.070.71±0.040.94±0.051.23±0.051)GEF0.34±0.030.41±0.070.78±0.081.10±0.101.41±0.112)MA+GEF0.32±0.040.36±0.040.43±0.050.51±0.070.68±0.043)4)

Note:MA vs Ctrl,1)P<0.001；GEF vs Ctrl,2)P<0.001；MA+GEF vs GEF,3)P<0.01；MA+GEF vs MA,4)P<0.05.

GroupsOD0 h24 h48 h96 h120 hCtrl0.33±0.150.63±0.151.17±0.251.70±0.102.20±0.10MA0.30±0.130.40±0.050.58±0.070.80±0.101.16±0.151)GEF0.31±0.110.43±0.070.71±0.080.93±0.151.13±0.152)MA+GEF0.34±0.010.38±0.020.47±0.020.65±0.050.78±0.073)4)

Note:MA vs Ctrl,1)P<0.001；GEF vs Ctrl,2)P<0.001；MA+GEF vs GEF,3)P<0.01；MA+GEF vs MA,4)P<0.05.

GroupsOD0 h24 h48 h96 h120 hCtrl0.31±0.050.71±0.121.37±0.151.83±0.032.46±0.32MA0.31±0.140.45±0.080.63±0.170.86±0.111.46±0.101)GEF0.33±0.010.47±0.010.67±0.110.93±0.121.33±0.092)MA+GEF0.32±0.130.39±0.040.51±0.060.67±0.070.81±0.063)4)

Note:MA vs Ctrl,1)P<0.001；GEF vs Ctrl,2)P<0.001；MA+GEF vs GEF,3)P<0.01；MA+GEF vs MA,4)P<0.05.

圖2 經(jīng)過(guò)各組藥物處理之后的人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116，SW480和SW620的克隆形成能力變化

GroupsClone formation number(individual)HCT116SW480SW620Ctrl185±17166±13153±12MA50±61) 52±91) 57±111)GEF46±32)41±42)38±22)MA+GEF 22±33)4) 12±43)4) 8±23)4)

Note:MA vs Ctrl,1)P<0.001；GEF vs Ctrl,2)P<0.001；MA+GEF vs GEF,3)P<0.01；MA+GEF vs MA,4)P<0.05.

2.4聯(lián)合用藥抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系的遷移能力 與空白對(duì)照組比較，單用MA或者單用GEF人結(jié)腸癌細(xì)胞系遷移能力顯著降低(P<0.05)；而二者聯(lián)用與單一用藥組比較細(xì)胞的遷移能力顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表6。

2.5聯(lián)合用藥對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系的凋亡影響 與空白對(duì)照組,單用MA或者單用GEF處理后，人結(jié)腸癌細(xì)胞系的凋亡比例顯著增加(P<0.05)；聯(lián)合使用MA+GEF組，細(xì)胞凋亡比例明顯高于單一用藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖5、表7。

2.6聯(lián)合用藥對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白及增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響 與空白組及單用MA或者單用GEF組比較，聯(lián)合使用MA+GEF組的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的Vemintin、SNAIL、Cyclin D1的蛋白水平顯著下降，而Caspase-3、Bax的表達(dá)則明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖6、表8。

GroupsG1/G0 Phase cell proportion(%)HCT116SW480SW620Ctrl50.91±0.3756.52±0.2072.73±0.79MA65.91±1.0277.17±0.9481.15±0.99GEF61.56±0.8679.42±0.0987.14±1.00MA+GEF94.14±0.1087.47±0.0794.45±1.24

Note:MA alone or GEF alone can increase the proportion of cells in the G0/G1phase of human colon cancer cell line,especially after combined administration.

圖3 經(jīng)過(guò)各組藥物處理之后的人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116，SW480和SW620的周期分布變化

圖4 經(jīng)過(guò)各組藥物處理之后的人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480和SW620的細(xì)胞遷移能力變化

2.7聯(lián)合用藥對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系中AMPK信號(hào)通路的影響 MA組、GEF組及聯(lián)合用藥組中的HCT116細(xì)胞內(nèi)P-AMPK的蛋白水平顯著高于無(wú)藥物組，而P-mTOR的蛋白表達(dá)量則明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖7、表9。

GroupsCell migration abilityHCT116SW480SW620Ctrl61.67±1.5268.33±1.5279.67±4.16MA27.67±3.781)30.33±4.721)43.67±6.021)GEF18.00±2.002)28.00±3.122)37.12±5.562)MA+GEF4.12±3.253)4)7.67±3.213)4)3.33±3.213)4)

Note:MA vs Ctrl,1)P<0.001；GEF vs Ctrl,2)P<0.001；MA+GEF vs GEF,3)P<0.01；MA+GEF vs MA,4)P<0.05.

圖5 各組藥物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480和SW620的凋亡比例的影響

圖6 各組藥物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480和SW620中Bax、Caspase-3、Cyclin-D1、SNAIL及Vemintin蛋白表達(dá)水平的影響

圖7 各組人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中P-AMPK、AMPK、P-mTOR和mTOR的蛋白表達(dá)

GroupsGray value of proteinCaspase-3/GAPDHBax/GAPDHCyclin-D1/GAPDHSNAIL/GAPDHVemintin/GAPDHCtrl0.08±0.010.06±0.020.89±0.020.85±0.020.86±0.01MA0.25±0.011)0.15±0.041)0.67±0.041)0.47±0.021)0.58±0.031)GEF0.26±0.012)0.22±0.012)0.51±0.042)0.59±0.062)0.44±0.012)MA+GEF0.86±0.043)4)0.84±0.033)4)0.16±0.053)4)0.14±0.023)4)0.13±0.043)4)

Note:MA vs Ctrl,1)P<0.001；GEF vs Ctrl,2)P<0.001；MA+GEF vs GEF,3)P<0.01；MA+GEF vs MA,4)P<0.05.

GroupsApoptosis ratioHCT116SW480SW620Ctrl6.00±1.215.67±2.085.67±2.51MA23.01±2.011)22.33±2.081)21.33±1.521)GEF23.33±2.512)24.67±2.082)22.33±2.082)MA+GEF43.21±2.023)4)42.14±43)4)44.33±1.523)4)

Note:MA vs Ctrl,1)P<0.001；GEF vs Ctrl,2)P<0.001；MA+GEF vs GEF,3)P<0.01；MA+GEF vs MA,4)P<0.05.

3 討論

EGFR在諸多類型的腫瘤中均有異常表達(dá)，研究顯示EGFR在結(jié)腸癌中處于高表達(dá)狀態(tài)，且其高表達(dá)與不良的臨床預(yù)后有著密切關(guān)系[14]，這為結(jié)腸癌的分子靶向治療提供了理論依據(jù)。吉非替尼是EGFR酪氨酸激酶抑制劑，不斷有研究提出，吉非替尼在抑制結(jié)腸癌的進(jìn)程中起重要作用[15]，也能與其他化療藥物起到協(xié)同作用[16]，但是也有文章指出患者在接受治療的一段時(shí)間之后逐漸出現(xiàn)對(duì)吉非替尼的抵抗性[17,18]，而且臨床Ⅰ/Ⅱ期研究發(fā)現(xiàn)吉非替尼對(duì)于晚期結(jié)腸癌患者治療效果欠佳[14],也不能增加其他化療藥物的療效[15]，甚至過(guò)度用藥會(huì)導(dǎo)致許多副作用，如中性粒細(xì)胞減少、腹瀉、惡心和嘔吐等，使得很多患者無(wú)法耐受以至于中斷治療。多種藥物聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)成為臨床上常見(jiàn)的治療晚期結(jié)腸癌患者的共識(shí)，如何能最大限度抑制腫瘤的基礎(chǔ)上同時(shí)提高用藥的安全性及減少藥物副作用成為臨床上的一大難點(diǎn)。而中藥因其溫和的藥性得以廣泛應(yīng)用于臨床，很多傳統(tǒng)中藥相繼被報(bào)道有抑癌作用。苦參堿是從苦參中提取出來(lái)的主要成分，其性寒味苦，有清熱解毒的作用，有報(bào)道指出苦參堿能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的周期分布從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16]，或者能增加化療藥物的療效，從而減少化療藥物的用量及藥物毒副作用[17]。近年來(lái)，很多文獻(xiàn)報(bào)道苦參堿在體內(nèi)體外均可以抑制結(jié)腸癌的腫瘤進(jìn)程，其機(jī)制主要涉及細(xì)胞周期阻滯、轉(zhuǎn)移和侵襲能力抑制等[18]。也有報(bào)道苦參堿可以協(xié)同多種化療藥物如紫杉醇[19]、奧沙利鉑[20]、雷替曲塞[21]等，但苦參堿聯(lián)合吉非替尼在結(jié)腸癌的治療中卻無(wú)報(bào)道。

GroupGray value of proteinP-mTOR/GAPDHP-AMPK/GAPDHCtrl0.64±0.040.09±0.02MA0.37±0.041)0.21±0.011)GEF0.26±0.012)0.29±0.012)MA+GEF0.09±0.013)4)0.38±0.013)4)

Note:MA vs Ctrl,1)P<0.001；GEF vs Ctrl,2)P<0.001；MA+GEF vs GEF,3)P<0.01；MA+GEF vs MA,4)P<0.05.

本次研究發(fā)現(xiàn)，單用吉非替尼或者苦參堿均能在一定程度上抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖能力和克隆形成能力，但是二者聯(lián)合應(yīng)用則可以在更大程度上起到抑制作用，已有文獻(xiàn)報(bào)道吉非替尼或者苦參堿的周期阻滯作用，我們的研究發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)用后結(jié)腸癌細(xì)胞系發(fā)生顯著的G0/G1期阻滯，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖受阻，這在克隆形成能力受阻中也可以得到驗(yàn)證，而相對(duì)于單用藥物組，G0/G1期的周期蛋白Cyclin-D1的表達(dá)也在聯(lián)用之后有更為顯著的減少。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)，單用吉非替尼或者苦參堿可以一定程度抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移能力，但是二者聯(lián)用后可以更大程度地抑制其轉(zhuǎn)移能力;Vemintin和SNAIL的蛋白表達(dá)水平也在聯(lián)用之后明顯減少，意味著二者聯(lián)用比單一用藥可以更大程度減少結(jié)腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。吉非替尼或者苦參堿殺傷腫瘤細(xì)胞的作用主要包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，單用苦參堿或者吉非替尼確實(shí)能在一定程度上增加結(jié)腸癌細(xì)胞系的凋亡比例，但是二者聯(lián)用后凋亡比例明顯比單用藥物組增加，相應(yīng)的凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達(dá)也有明顯增加，這提示我們，二藥聯(lián)用可能協(xié)同或者相加地抑制結(jié)腸癌的進(jìn)程。中藥苦參堿在臨床治療中副作用少，與吉非替尼聯(lián)用可以減少吉非替尼的用藥量，減少吉非替尼所致的腸道副作用，提高患者的生活質(zhì)量。此外，研究中觀察到單獨(dú)用藥組其P-AMPK的蛋白表達(dá)水平有一定程度的提高，二者聯(lián)用之后，P-AMPK表達(dá)水平顯著高于單藥組，但其下游分子P-mTOR的蛋白表達(dá)水平則趨勢(shì)相反，這意味著二藥聯(lián)用作用于結(jié)腸癌細(xì)胞之后可能激活P-AMPK通路，起到抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，并誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，最終達(dá)到抑制結(jié)腸癌進(jìn)程的作用。

總而言之，苦參堿和吉非替尼聯(lián)用可以顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系在體外的增殖和轉(zhuǎn)移能力，并能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞系發(fā)生凋亡，而起到抑制腫瘤進(jìn)程的作用，此作用可能與藥物聯(lián)用之后激活A(yù)MPK信號(hào)通路有關(guān)。