周思瑤 游雷鳴 張海麗 趙夢繁 蘇日娜 劉 慧 郝 鈺

(北京中醫(yī)藥大學生命科學學院免疫與微生物學系,北京 100029)

漢黃芩素是從中藥黃芩、半枝蓮等植物中分離得到的一種重要的黃酮類化合物。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩素具有明顯抗炎作用[1]。且相關研究表明，漢黃芩素可通過抑制NF-κB和MAPK信號通路抑制LPS誘導的大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元炎癥反應[2]。漢黃芩素能通過抗炎及抗氧化作用來減輕糖尿病性心肌病[3]。且漢黃芩素還可通過抑制氧化應激誘導的MAPK和NF-κB途徑來減輕大鼠體內(nèi)鎘誘導的腎毒性[4]。還有文獻表明，漢黃芩素可通過激活Nrf2/HO-1-SOD2-NQO-1-GCLC信號轉(zhuǎn)導軸來抑制IL-1β刺激引起的MAPK信號通路活化，從而抑制炎癥反應[5]。我們從大量參考文獻中得出，漢黃芩素具有明顯的抗氧化應激及抗炎作用。

我們課題組已有前期研究證明，漢黃芩素能抑制 LPS-ATP 聯(lián)合刺激巨噬細胞炎癥反應的發(fā)生，與 LPS 和 ATP 聯(lián)合刺激組相比，漢黃芩素干預組能明顯降低胞內(nèi) IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3和 Caspase-1 的 mRNA 水平，減少NF-κB核轉(zhuǎn)位，并能下調(diào)胞外TNF-α和胞內(nèi)ROS水平[6]。ROS是氧化應激的重要產(chǎn)物，大量的ROS又可以激活巨噬細胞的核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB使其發(fā)生核轉(zhuǎn)位，誘導炎癥反應[7]。由此，我們認為漢黃芩素可能是通過降低胞內(nèi)的ROS水平，減少NF-κB核轉(zhuǎn)位，抑制NF-κB介導的炎癥基因轉(zhuǎn)錄繼而減輕巨噬細胞的炎癥反應。那么，是什么機制使胞內(nèi)ROS水平降低的？是漢黃芩素直接減少ROS產(chǎn)生和釋放還是通過激活抗氧化信號通路降解過多的ROS？Nrf2信號通路是細胞內(nèi)氧化應激最重要的防御系統(tǒng)之一，當細胞發(fā)生氧化應激，Nrf2 信號通路首先被激活，進而引發(fā)抗氧化物及相關酶類的大量表達，以抵御氧化應激引發(fā)的細胞損傷，減少ROS產(chǎn)生[8]。為此，本研究以脂多糖和三磷酸腺苷聯(lián)合刺激小鼠巨噬細胞為炎癥模型,從抗氧化的角度探究漢黃芩素抑制巨噬細胞炎癥反應的作用機制，并探究漢黃芩素對Nrf2信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 小鼠巨噬細胞系RAW264.7(ATCC:TIB-71),由北京中醫(yī)藥大學免疫與微生物學系實驗室保存。漢黃芩素購自中國藥品生物制品檢定所,反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ATP購自TaKaRa公司,RNA提取試劑TRIZOL購自Invitrogen公司,SYBGreen熒光定量PCR試劑盒購自ToYoBo公司,LPS購自Sigma公司,SOD、MDA檢測試劑盒購自凱基生物公司,胎牛血清購自HyClone公司,Anti-Nrf2抗體、山羊抗兔IgG購自Abcam公司，4%組織細胞固定液購自索萊寶公司，山羊血清購自中杉金橋公司，NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。引物采用Primer5.0設計,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞用含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鏡下觀察細胞密度達80%左右予以傳代。

1.2.2檢測試劑盒測定巨噬細胞SOD、MDA、NO的分泌水平 將對數(shù)生長期的巨噬細胞RAW264.7接種到6孔板中(1×106個細胞/孔)，設對照組(正常培養(yǎng)不予以刺激)、模型組(先加LPS刺激4 h后再加ATP刺激30 min,LPS和ATP終濃度均為 1 μg/ml)和漢黃芩素(56 μmol/L、28 μmol/L、14 μmol/L)干預組(加入LPS的同時加入漢黃芩素，4 h后加ATP刺激30 min),每組4個復孔。取培養(yǎng)皿中的上清，按照SOD、MDA、NO檢測試劑盒說明書，分別對各組細胞上清中的SOD、MDA、NO水平進行檢測。

1.2.3免疫熒光法檢測巨噬細胞Nrf2核轉(zhuǎn)位 將巨噬細胞RAW264.7制成細胞濃度為1×104個/ml的細胞懸液，接種1 ml到20 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中。設對照組、模型組、漢黃芩素干預組，各組處理方式同方法1.2.2。待細胞生長至50%～60%，吸凈培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞(3次,3 min/次)。每皿加2 ml 4%多聚甲醛溶液,室溫固定細胞15 min，用PBS清洗細胞(3次,3 min/次)。接著,用0.1%Triton X-100處理細胞15 min(室溫透化),PBS清洗細胞(3次,5 min/次),然后用山羊血清封閉細胞1 h(每皿1 ml),吸凈封閉液，加入兔抗Nrf2抗體工作液(山羊血清1∶500稀釋)，37℃孵育2 h。PBS洗細胞(3次，5 min/次)，加入羊抗兔IgG的二抗工作液(山羊血清1∶500稀釋)，37℃孵育1 h。PBS洗細胞(3次，5 min/次)。加入DAPI對細胞核染色(藍色)，室溫避光孵育5 min。PBS洗細胞(3次,5 min/次)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察Nrf2(紅色)的定位情況。

1.2.4RT-qPCR檢測巨噬細胞Nrf2和抗氧化酶mRNA水平 將巨噬細胞RAW264.7接種到6孔板中(2×106個細胞/孔),設對照組、模型組、漢黃芩素(56 μmol/L、28 μmol/L、14 μmol/L)干預組,每組3個復孔，各組處理方法與1.2.2相同。棄去各孔培養(yǎng)基后用PBS清洗各孔細胞,加入TRIZOL試劑裂解細胞(500 μl/孔),參照說明書的操作要求分別提取各孔細胞的總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明,各取1 μg RNA配制10 μl反轉(zhuǎn)錄體系合成相應的cDNA,得到的cDNA用DEPC水做10倍稀釋后備用。取1 μl稀釋后的cDNA作為模板,以小鼠GAPDH基因作為內(nèi)參,加入相應的引物(表1),利用實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測各組樣品中相應基因的mRNA水平。定量分析基因包括Nrf2、HO-1、SOD、GPx、CAT以及NQO-1,qPCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行處理和分析。

表1 設計并合成的引物

Tab.1 Primers designed and synthesized in this study

PrimersSequence(5'to 3')qR_Nrf2-FTCTGAGCCAGGACTACGACGqR_Nrf2-R GAGGTGGTGGTGTCTCTGCqR_HO-1-FACAGGTTGACAAGAAGAGGCTAAqR_HO-1-RAACAGGAAGCTGAGAGTGAGGqR_SOD-FGCCCGCTAAGTGCTGAGTCqR_SOD-RAGCCCCAGAAGGATAACGGAqR_GPx-FAGGGTAGAGGCCGGATAAGGqR_GPx-RCGAGCAGCACACATACTGGAqR_CAT-FCTGAGAGAGGGTACACGCAqR_CAT-RGAGCCTGACTCTCCAGTGACqR_NQO-1-FGAGAGGATGGGAGGTACTCGqR_NQO-1-RAATATCTGGGCTCAGGCGTC

2 結果

2.1漢黃芩素干預能明顯降低LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細胞MDA、NO分泌水平 模型組(LPS-ATP聯(lián)合刺激)與對照組相比，巨噬細胞分泌的NO、MDA顯著增多；與模型組相比，漢黃芩素干預組能夠明顯降低巨噬細胞NO、MDA的分泌水平(表2)。

2.2漢黃芩素能促進LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細胞Nrf2 mRNA表達及胞內(nèi)Nrf2的核轉(zhuǎn)位 熒光定量PCR結果顯示，與對照組相比，模型組(LPS-ATP聯(lián)合刺激)巨噬細胞中的Nrf2 mRNA水平顯著升高；與模型組相比，漢黃芩素低劑量干預組(14 μmol/L)巨噬細胞中的Nrf2 mRNA水平明顯升高(圖1A)。免疫熒光法觀察巨噬細胞內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位發(fā)現(xiàn)，對照組巨噬細胞內(nèi)Nrf2幾乎不表達，模型組Nrf2明顯表達，但多在胞漿內(nèi)，漢黃芩素干預組巨噬細胞內(nèi)Nrf2明顯表達，且細胞核內(nèi)的Nrf2表達量較模型組明顯增多(圖1B、C)。

2.3漢黃芩素能夠上調(diào)LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細胞抗氧化酶HO-1、SOD、GPx、CAT以及NQO-1的mRNA水平 熒光定量PCR結果顯示，與對照組相比，模型組巨噬細胞中抗氧化酶HO-1、SOD、GPx、CAT、NQO-1的mRNA水平顯著降低。在LPS-ATP聯(lián)合刺激時加入漢黃芩素干預，細胞中這些抗氧化酶的mRNA水平顯著升高(圖2)。

GroupsMDA(nmol/ml)NO(μmol/L)Control group0.34±0.0327.84±0.55Model group1.14±0.071)44.51±2.081)Low dose wogonin(14 μmol/L)0.88±0.112)23.87±1.522)Middle dose wogonin( 28 μmol/L)0.75±0.092)40.30±0.92High dose wogonin(56 μmol/L)0.67±0.062)30.12±1.172)

Note:Compared to Control group,1)P<0.01;compared to Model group,2)P<0.01.

圖1 漢黃芩素對LPS和ATP刺激的巨噬細胞(RAW264.7)Nrf2 mRNA水平及Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響

圖2 漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合刺激的RAW264.7細胞抗氧化酶mRNA水平的影響

圖3 漢黃芩素對LPS和ATP聯(lián)合刺激的RAW264.7細胞SOD活性的影響

2.4漢黃芩素能明顯提高LPS和ATP聯(lián)合刺激的巨噬細胞SOD活性 模型組(LPS-ATP聯(lián)合刺激)與對照組相比,SOD活性顯著降低；與模型組相比，漢黃芩素干預組能顯著逆轉(zhuǎn)SOD活性被抑制的情況(圖3)。

3 討論

炎癥是機體對各種致炎因素引起組織損害而產(chǎn)生的一種基本病理過程，也是許多疾病的重要發(fā)生機制。適當?shù)难装Y反應作為機體的一種自我保護機制是有益的，但過度炎癥反應則會造成組織器官嚴重的病理損傷。我們課題組的前期研究表明，漢黃芩素能顯著抑制LPS和ATP聯(lián)合誘導的巨噬細胞RAW264.7的炎癥反應，能明顯降低胞內(nèi)IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3和Caspase-1的mRNA水平，減少NF-κB核轉(zhuǎn)位，并能下調(diào)胞外TNF-α和胞內(nèi)ROS水平[6]。ROS又稱活性氧，其產(chǎn)生與炎癥密切相關。有研究表明，ROS可以激活巨噬細胞的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB核轉(zhuǎn)位，誘導炎癥反應[7]。還有研究表明，細胞應激后ROS濃度增加導致硫氧還蛋白(TXNIP也稱為VDUP1)從氧化硫氧還蛋白-1(Trx-1)中解離，TXNIP隨后與NLRP3相結合并激活NLRP3炎性小體[9]。這些都說明漢黃芩素對巨噬細胞炎癥的抑制作用可能與其下調(diào)胞內(nèi)ROS水平有關，那么漢黃芩素又是通過什么機制下調(diào)胞內(nèi)ROS水平的呢？眾所周知，ROS是氧化應激的重要產(chǎn)物，而氧化應激的發(fā)生是由于機體或細胞遭受內(nèi)源性或外源性的有害物質(zhì)刺激后，產(chǎn)生大量的自由基，釋放出過多的活性氧簇(ROS)、活性氮簇(RNS)等氧化物質(zhì)，而機體或細胞本身的抗氧化能力下降，機體的氧化反應大大超出抗氧化的清除能力，導致大量積累的 ROS等[11]氧化物不能被清除，從而誘導細胞損傷，并促進炎癥反應發(fā)生[10]。反過來，炎癥細胞在炎癥部位釋放出許多活性物質(zhì)，也會導致氧化應激加劇。薛嘉虹等[11]研究表明，炎癥因子 TNF-α 可增強 NADPH 氧化酶的表達，并抑制抗氧化酶SOD的表達，導致氧化應激反應的發(fā)生，而抑制 TNF-α 的表達，可有效地抑制氧化應激反應。由此可見，氧化應激和炎癥是密切相關的病理生理過程，常相伴而生。據(jù)此，本研究以LPS和ATP聯(lián)合刺激的RAW264.7小鼠巨噬細胞為炎癥細胞模型，從抗氧化應激的角度探究漢黃芩素下調(diào)ROS水平的作用機制，從而證明漢黃芩素能否通過抑制氧化應激下調(diào)ROS水平，進而抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位，減少NLRP3活化，最終抑制炎癥反應的發(fā)生。

NO是活性氮簇(RNS)中的一種，是氧化應激的重要產(chǎn)物，其分泌水平能反映氧化應激的程度。氧化應激生成過多的ROS會引起細胞發(fā)生過氧化脂質(zhì)反應，使細胞膜受到損傷，破壞細胞的功能和結構，而丙二醇(MDA)作為過氧化脂質(zhì)產(chǎn)生的終末產(chǎn)物是公認的氧化應激標志物。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組巨噬細胞NO、MDA的分泌水平顯著提高，而漢黃芩素干預組相對于模型組其細胞NO、MDA的分泌水平顯著降低，說明炎癥反應能伴隨氧化應激的發(fā)生，漢黃芩素能抑制氧化應激的發(fā)生。

Nrf2信號通路是細胞內(nèi)氧化應激最重要的防御系統(tǒng)之一，當細胞發(fā)生氧化應激，Nrf2 信號通路首先被激活，Nrf2因子核轉(zhuǎn)位與抗氧化反應元件(anti-oxidant response element，ARE)上的DNA 基序(GCTGAGTCA)識別并結合，啟動抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，進而引發(fā)抗氧化物及相關酶類的大量表達，包括 NADPH、 NQO-1、 HO-1、 SOD、 GPx 和 GST 等，以抵御氧化應激引發(fā)的細胞損傷[7]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，漢黃芩素干預組能顯著提高巨噬細胞內(nèi)Nrf2 mRNA水平，促進Nrf2的核轉(zhuǎn)位，并能顯著上調(diào)抗氧化酶HO-1、SOD、GPx、CAT、NQO-1的mRNA水平，增加SOD活性，說明漢黃芩素可激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2進行核轉(zhuǎn)位，啟動抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，促進抗氧化酶蛋白的表達，從而發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，LPS與ATP聯(lián)合刺激巨噬細胞能夠引起細胞的氧化應激，漢黃芩素可能通過激活Nrf2核轉(zhuǎn)位，啟動抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導抗氧化酶的表達，清除過量的自由基，包括ROS、NO等，繼而抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，減少NLRP3炎性體活化，從而發(fā)揮抑制炎癥反應的作用。本研究在一定程度上豐富了漢黃芩素抗炎抗氧化的作用機制，然而，其抗氧化的具體分子機制，如漢黃芩素是如何激活Nrf2核轉(zhuǎn)位的，對Nrf2-ARE信號通路上的關鍵信號分子有何影響仍有待進一步的研究。