王 慶 李天一 吳國琳 盧雯雯 陳 玖

(浙江省立同德醫(yī)院，杭州 310012)

干燥綜合征(sjogren′s syndrome，SS)是一種以高度淋巴細(xì)胞浸潤為特征的常見風(fēng)濕免疫性疾病，以侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺體為主。臨床表現(xiàn)以眼干、口干為最多見，其他部位如肺、肝、胰腺、腎臟及血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等也可被累及。SS發(fā)病有嚴(yán)重的女性傾向，女性與男性的患病比率高至(9～20)∶1，平均發(fā)病年齡通常在40～50歲[1]。

SS病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。近年的研究逐漸認(rèn)識到Tfh細(xì)胞對自身免疫性疾病的影響，其相關(guān)分子在免疫應(yīng)答中起重要作用[2]，有實(shí)驗(yàn)證明Tfh細(xì)胞可能與原發(fā)性干燥綜合征的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[3]，對外分泌腺中生發(fā)中心的形成和維持至關(guān)重要[4]。Tfh細(xì)胞參與B細(xì)胞激活，此功能來源于Tfh-B淋巴細(xì)胞的表面相互作用，Tfh細(xì)胞分泌的CXCR5是參與B細(xì)胞激活的關(guān)鍵細(xì)胞因子[5]，而BCL-6是Tfh的特異性轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示干燥綜合征病人的Tfh細(xì)胞有明顯升高的BCL-6表達(dá)[6]。

目前，干燥綜合征尚無特效治療方法，西醫(yī)主要采用替代和對癥治療[7]，而中醫(yī)藥治療SS有明顯優(yōu)勢。課題組前期研究表明養(yǎng)陰益氣活血方對SS療效確切，不僅能改善臨床癥狀，還能提高患者的生活質(zhì)量，它能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2的免疫平衡、Fas/FasL、AQP-5及其mRNA、TNF-α、IL-1β等的表達(dá)起作用[8,9]。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，探討Tfh細(xì)胞相關(guān)分子BCL-6、 CXCR5與干燥綜合征的相關(guān)性，從對Tfh細(xì)胞相關(guān)分子BCL-6、 CXCR5的調(diào)節(jié)角度闡釋中藥養(yǎng)陰益氣活血方治療SS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 NOD小鼠30只，雌性8周齡，體重(21.822±0.814)g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司(動物合格證號：20130016000707)，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物室(溫度25℃，濕度46%RH)。

1.1.2主要試劑 兔抗鼠BCL-6單克隆抗體[EPR11410-43]ab172610、兔抗鼠CXCR5多克隆抗體ab203212，均由abcam公司生產(chǎn)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)用藥 養(yǎng)陰益氣活血方：太子參15 g，五味子9 g，山茱萸15 g，女貞子15 g，紅景天15 g，腫節(jié)風(fēng)10 g，丹參15 g，白芍10 g，黃精10 g，山藥30 g，烏梅6 g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中藥房提供，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室煎煮、濃縮成含生藥2.25 g/ml的藥液。

硫酸羥氯喹片:0.1 g/片，由上海上藥中西制藥有限公司生產(chǎn)，批號:H19990263.用蒸餾水稀釋成含生藥量3 mg/ml的混懸液。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與給藥 將30只NOD小鼠隨機(jī)分為4組，即：模型組(Model group)6只(灌服去離子水0.4 ml)，中藥組(TCM group)8只(灌服中藥養(yǎng)陰益氣活血煎劑0.4 ml)，西藥組(WM group)8只(灌服羥氯喹0.4 ml)，結(jié)合組(ITCWM group)8只(灌服養(yǎng)陰益氣活血煎劑和羥氯喹0.4 ml)。各組小鼠自由進(jìn)食，飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，各給藥組小鼠每日灌胃、給藥、飼養(yǎng)8周。

1.2.2取材與材料處理 灌胃8周后，處死小鼠，解剖摘取雙側(cè)頜下腺并稱重，將頜下腺置于4%多聚甲醛中固定后，經(jīng)流水過夜置于自動脫水機(jī)中脫水。然后進(jìn)行浸蠟包埋，自然冷卻后放入4℃冰箱中保存，用切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm，置于41℃蒸餾水后揀出、烘烤，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3觀察指標(biāo)及方法

1.2.3.1小鼠一般情況觀察 每天觀察各組小鼠的皮毛、色澤、活動量、尾部瘀斑、糞便等情況。每3 d 記錄小鼠的飲水量。

1.2.3.2頜下腺指數(shù) 頜下腺指數(shù)=雙側(cè)頜下腺重量(mg)/小鼠體重(g)。

1.2.3.3頜下腺病理形態(tài)觀察及評價 將頜下腺置于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下成像并掃描成電子圖片觀察其組織形態(tài)，根據(jù)Chisholm-Mason組織學(xué)評分方法將各組小鼠頜下腺病變輕重程度進(jìn)行量化分析，評價標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.4頜下腺組織BCL-6、CXCR5的表達(dá) 采用免疫組化法檢測各小鼠頜下腺組織BCL-6、CXCR5的表達(dá)，按照試劑盒說明書嚴(yán)格操作。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠一般情況 在飼養(yǎng)過程中西藥組有1只小鼠死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)食道損傷，推測是因?yàn)楣辔覆僮鲹p傷引起死亡。各組NOD小鼠中均存在不同程度、不同部位脫毛現(xiàn)象且逐漸加重，尾部逐漸出現(xiàn)少量瘀點(diǎn)或瘀斑，模型組脫毛現(xiàn)象尤其嚴(yán)重；其次NOD小鼠除個別精神萎靡倦怠嗜睡外，大多精神狀態(tài)可。

表1 SS模型小鼠頜下腺病理學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)

Tab.1 Evaluation criteria of submandibular gland pathology in SS model mice

ScoreGradePathological grading standard00Minimal lymphocyte infiltration11A small amount of scattered lymphocyte infiltration22Moderate lymphocyte infiltration(not focal)with mild parenchymal damage330-1 lymphocyte infiltrating foci/5 low-power fields with moderate parenchyma damage442-3 lymphocyte infiltration foci/5 low-power fields with severe parenchyma lesions

Note:A single focal center is a collection of 50 or more lymphocytes,plasma cells,or histiocytes.

圖1 平均每只小鼠每三天的飲水量

表2 各組小鼠的平均頜下腺指數(shù)比較

Tab.2 Mean submandibular gland index of each group

GroupNumberMean submandibulargland mass(mg)Submandibulargland index(mg/g)Model group697.03.67±0.75TCM group899.33.92±0.61WM group782.83.44±0.621)ITCWM group8100.44.25±0.47

Note:Compared to the combined group，1)P<0.05.

2.2各組小鼠的飲水量比較 從折線圖可以看出模型組小鼠飲水量明顯高于其他各組且呈明顯的上升趨勢，各用藥組除結(jié)合組較平穩(wěn)外，其余各組均有不同程度的上升趨勢，上升程度由高到低依次是模型組、中藥組、西藥組、結(jié)合組(見圖1)。

2.3各組小鼠頜下腺指數(shù)比較 見表2。

2.4各組小鼠頜下腺組織病理形態(tài)觀察 光鏡下頜下腺病理觀察顯示，模型組頜下腺可見間質(zhì)中有大量淋巴細(xì)胞浸潤，形成多個淋巴細(xì)胞浸潤灶，腺泡大小不等，腺體萎縮，部分有破壞，以導(dǎo)管周圍為明顯。給藥組小鼠頜下腺病理形態(tài)學(xué)觀察可見程度不等的淋巴細(xì)胞浸潤灶和間質(zhì)散在的單個淋巴細(xì)胞浸潤，腺泡大小不等，偶見有少量導(dǎo)管和腺泡結(jié)構(gòu)破壞(見圖2)。

圖2 各組小鼠頜下腺病理觀察

圖3 頜下腺組織病理評分非參數(shù)秩和檢驗(yàn)

圖4 各組頜下腺組織BCL-6蛋白顆粒的表達(dá)

圖5 各組小鼠頜下腺CXCR5蛋白顆粒的表達(dá)

表3 各組小鼠頜下腺BCL-6、CXCR5的平均光密度

Tab.3 Average optical density of submandibular gland BCL-6 and CXCR5 in each group

GroupsNumberAverage optical density(x±s)BCL-6CXCR5Model group60.074±0.01 0.219±0.014TCM group8 0.069±0.0072)3)0.213±0.011)WM group70.073±0.0090.214±0.02ITCWM group8 0.07±0.0052)3) 0.212±0.0131)

Note:Compared to the model group，1)P<0.05；compared to the model group，2)P<0.01；compared to the western medicine group，3)P<0.01.

2.5各組小鼠頜下腺組織病理評分比較 各組小鼠頜下腺組織病理評分比較顯示，結(jié)合組顯著低于模型組(P<0.05)，其他組之間無顯著差異，但在中位數(shù)上結(jié)合組和中藥組低于模型組和西藥組(見圖3)。

2.6各組小鼠頜下腺組織BCL-6、CXCR5的表達(dá)

2.6.1小鼠頜下腺組織BCL-6、CXCR5免疫組化表達(dá)(見圖4、5) BCL-6蛋白顆粒主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞灶中,分布于淋巴細(xì)胞細(xì)胞核上，CXCR5蛋白顆粒也主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞灶中，分布于淋巴細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上，亦有少數(shù)陽性淋巴細(xì)胞散在分布于間質(zhì)，模型組呈棕褐色或棕黃色的強(qiáng)陽性反應(yīng)，用藥組呈棕褐色—淡黃色的陽性反應(yīng)，結(jié)合組的陽性反應(yīng)明顯偏弱。

2.6.2各組小鼠頜下腺組織BCL-6和CXCR5的表達(dá)的平均光密度比較(見表3) 從表中看出，BCL-6平均光密度中藥組和結(jié)合組明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；同時中藥組和結(jié)合組顯著低于西藥組(P<0.01)。CXCR5平均光密度中藥組和結(jié)合組低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

原發(fā)性干燥綜合征(primary sjogren′s syndrome,pSS)因其B淋巴細(xì)胞高反應(yīng)性和多克隆免疫球蛋白的產(chǎn)生被認(rèn)為是一種自身免疫病，在病理上以淋巴細(xì)胞浸潤的生發(fā)中心為主要表現(xiàn)，其內(nèi)大多數(shù)為CD4+T 細(xì)胞，也有CD8+T 細(xì)胞，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[10]。濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cells,Tfh)高表達(dá)趨化因子受體CXCR5，在適當(dāng)?shù)臈l件下被趨化至外周淋巴組織濾泡中，是一種CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，輔助B細(xì)胞進(jìn)行體液免疫[11]。其基本功能特征為在生發(fā)中心濾泡內(nèi)輔助 B 細(xì)胞增殖分化出漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞，產(chǎn)生大量免疫球蛋白以及多克隆抗體，并且也顯著影響抗體親和力成熟、高頻突變、類別轉(zhuǎn)換等過程，因此對生發(fā)中心的形成至關(guān)重要[12]。有臨床研究[13]表明Tfh細(xì)胞比例在明顯病程階段的pSS病人是升高的，而且升高的Tfh細(xì)胞比例與某些B細(xì)胞亞型比例和自身抗體水平有很明確的相關(guān)性，即Tfh細(xì)胞也許對SS疾病發(fā)展起重要作用，因此調(diào)節(jié)Tfh細(xì)胞相關(guān)分子可以成為治療pSS的新靶點(diǎn)。BCL-6是序列特異性的轉(zhuǎn)錄抑制子，主要表達(dá)于CXCR5hi的Tfh，是CXCR5等Tfh表面標(biāo)志物表達(dá)的自變量且與之成正相關(guān)，并且是Tfh分化的必要充分條件[14]，因此被稱為Tfh的特異性轉(zhuǎn)錄因子[15]。CXCR5為Tfh細(xì)胞的重要表面標(biāo)志物，是Tfh細(xì)胞遷移、定位到生發(fā)中心的趨化因子受體[12]。

NOD小鼠是較公認(rèn)的研究SS的實(shí)驗(yàn)動物，有研究在NOD小鼠的外分泌腺中檢測到淋巴細(xì)胞浸潤以及由此發(fā)展而來的涎腺炎和淚腺炎，同時也檢測到NOD小鼠和SS病人一樣的信號自身抗體包括ANA、anti-SSA/Ro、anti-SSB/La、120-kDaa-fodrin抗體和anti-M3R自身抗體等[16,17]。因此，NOD鼠被廣泛應(yīng)用于SS實(shí)驗(yàn)研究。

中醫(yī)古籍中無干燥綜合征病名，但與本病相關(guān)的論述，可散見于各醫(yī)著中，屬于“燥證”、“痹證”等范疇。《素問·陰陽應(yīng)象大論》篇有“燥勝則干”的記載。全國中醫(yī)痹病委員會著《痹病論治學(xué)》將干燥綜合征中醫(yī)命名為“燥痹”，認(rèn)為燥痹是由外燥或內(nèi)燥諸燥邪損傷氣血津液而致陰津耗損、氣虛血虧，導(dǎo)致肢體筋脈失養(yǎng)，肌肉失濡；瘀血痹阻，痰凝結(jié)聚而致脈絡(luò)不通；不榮則痛，不通則痛因而引起肢體疼痛，甚則肌膚枯澀、臟器損害的病癥[18]。燥痹臨床主要表現(xiàn)為口燥咽干，眼干少淚，或兼見皮膚干燥瘙癢、鼻干鼻衄、陰道黏膜干燥瘙癢等，關(guān)節(jié)酸痛，舌質(zhì)紅少苔、脈細(xì)，甚者吞咽困難，牙齒片狀脫落成猖獗性齲齒等癥狀。本病頑固復(fù)雜，纏綿難愈，病程較長。

前期研究結(jié)果顯示陰虛是SS最常見的證素，其次是血瘀和氣虛[19]，其對應(yīng)的治法則為養(yǎng)陰、活血、補(bǔ)氣。我們前期的臨床研究證明養(yǎng)陰益氣活血方應(yīng)用于干燥綜合征患者能起到較高的治愈率，與西藥聯(lián)合應(yīng)用時的療效明顯高于單純西藥治療[8]。前期的動物實(shí)驗(yàn)證明養(yǎng)陰益氣活血方能通過影響Th1/Th2的免疫平衡、TNF-α、IL-1β、Fas/FasL、AQP-5等分子的表達(dá)水平，改善頜下腺病理，有效阻止SS的病程進(jìn)展[20-23]。

養(yǎng)陰益氣活血方中以太子參為君，補(bǔ)益肺脾氣陰，臣以黃精、山藥益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)脾潤肺益腎，輔助太子參補(bǔ)益之功，并白芍、五味子、山茱萸、女貞子、烏梅養(yǎng)血斂陰生津，滋補(bǔ)肝腎，佐以腫節(jié)風(fēng)、紅景天、丹參活血化瘀止痛。諸藥合用，共達(dá)養(yǎng)陰生津、益氣補(bǔ)血、活血化瘀之用。

本研究對NOD小鼠飲水量、頜下腺指數(shù)、頜下腺病理形態(tài)的檢測結(jié)果證實(shí)了養(yǎng)陰益氣活血方對干燥綜合征的治療作用，而且結(jié)合組的治療效果最好，明顯優(yōu)于單純西藥治療。同時發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰益氣活血方可以明顯降低Tfh細(xì)胞相關(guān)分子BCL-6、CXCR5的表達(dá)，而西藥羥氯喹則對此分子通路無影響，因此可以推斷養(yǎng)陰益氣活血方可能通過下調(diào)Tfh細(xì)胞相關(guān)分子BCL-6、CXCR5的表達(dá)水平，較好地延緩SS的病理損害和病情進(jìn)展，改善病情。其具體作用機(jī)制將在今后工作中繼續(xù)深入研究。