張春燕，歐陽(yáng)晶，孫 剛，張修禮，王巍峰，楊云生

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種功能性腸病，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛，與排便相關(guān)或伴隨排便習(xí)慣改變，是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的疾病之一。目前，IBS的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚。我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)異丁酰輔酶A脫氫酶(isobutyryl-CoA dehydrogenase，ICD)在腹瀉型IBS患者結(jié)腸黏膜表達(dá)異常[1]。作為代謝相關(guān)酶ICD是哺乳動(dòng)物乙烯還原酶家族成員之一，屬于核編碼的線(xiàn)粒體黃素酶家族成員，它以可溶性同源四聚體的形式存在于線(xiàn)粒體的基質(zhì)中，涉及脂肪酸β-氧化以及亮氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸以及加壓素的代謝[2]。對(duì)人類(lèi)代謝組學(xué)的全基因組關(guān)聯(lián)研究顯示與β-氧化相關(guān)的許多代謝產(chǎn)物的正常變化具有很強(qiáng)的遺傳相關(guān)性[3-4]。雖然β-氧化的極端異常導(dǎo)致短鏈或中鏈?；鈮A脫氫酶缺乏易導(dǎo)致罕見(jiàn)病癥，但β-氧化不太嚴(yán)重的異常與許多成人慢性病如2型糖尿病、肥胖、癌癥、潰瘍性結(jié)腸炎和神經(jīng)退行性變有關(guān)[5]。ICD參與脂肪酸β-氧化，本研究進(jìn)一步觀察ICD在便秘型IBS(IBS with constipation，IBS-C)患者結(jié)腸黏膜的表達(dá)情況，以期為IBS發(fā)病機(jī)制提供進(jìn)一步佐證。

1 材料和方法

1.1 一般資料 按照羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)及羅馬Ⅲ科研診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇同時(shí)符合標(biāo)準(zhǔn)的IBS-C患者12例，男女各6例，年齡36～58(45.8±6.2)歲；選取健康對(duì)照者12例，男女各6例，年齡40～56(47.8±4.5歲)。均獲得知情同意，并經(jīng)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)前期研究的方法鉗取盲腸、乙狀結(jié)腸黏膜組織[1]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 結(jié)腸黏膜HE染色 各部位標(biāo)本以10%甲醛固定、石蠟包埋、4 μm厚連續(xù)切片，按常規(guī)進(jìn)行。病理切片的觀察由2名病理學(xué)專(zhuān)家完成。

1.2.2 Western Blot方法檢測(cè) 取20 μg所提取的蛋白經(jīng)過(guò)12%的分離膠分離，上樣量20 μg；一抗小鼠抗人ICD多克隆抗體(中國(guó)臺(tái)灣Abnova公司，效價(jià)1∶100)，室溫孵育1 h；二抗HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶10 000)室溫孵育1 h。用ECL顯色試劑對(duì)膜進(jìn)行顯色，結(jié)果分析以β-actin蛋白表達(dá)作為參照，應(yīng)用BioRad公司提供的QuantityOne分析軟件進(jìn)行圖像分析。測(cè)定目的顯影條帶和內(nèi)參照β-actin(稀釋度1∶2 000)的灰度值，結(jié)果以比值(樣本灰度值/內(nèi)參照灰度值)表示。

1.2.3 熒光定量PCR方法檢測(cè)ICD mRNA的表達(dá) 將分離的組織懸液200 μL 加入1 mL TRIzol，提取RNA;按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。根據(jù)基因總長(zhǎng)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。ICD引物序列：上游5′-GTGCCTGGATGATTGATAG-3′，下游5′-TCTCCCTGTTTCTTAGCG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-TTGTCAGCAATGCATCCTGCAC-3′，下游5′-ACAGCTTTCCAGAGGGGCCATC-3′，引物由上海英俊生物有限公司合成。

熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:下游引物各0.25 μL,滅菌注射用水7.5 μL,熒光定量PCR Mix10 μL,cDNA 2 μL,反應(yīng)總體系20 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 5 min;變性95 ℃ 30 s, 退火55 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,反應(yīng)40個(gè)循環(huán)；60 ℃ 30 s(收集溶解曲線(xiàn)),反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用實(shí)時(shí)定量PCR儀Bio-rad IQ5軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Western Blot方法檢測(cè)結(jié)腸黏膜ICD表達(dá)情況ICD在乙狀結(jié)腸黏膜的表達(dá)IBS-C組低于健康對(duì)照組(P<0.05)；ICD在IBS-C組乙狀結(jié)腸、盲腸的表達(dá)差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ICD在健康對(duì)照組乙狀結(jié)腸、盲腸表達(dá)差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖1。

A：ICD在乙狀結(jié)腸的表達(dá)；B：ICD在盲腸的表達(dá)(泳道1-3為健康對(duì)照組；泳道4-6為IBS-C組)；C：ICD/β-actin IBS-C組與健康對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)ICD mRNA的相對(duì)表達(dá)量與健康對(duì)照組比較，IBS-C組乙狀結(jié)腸ICD mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；與健康對(duì)照組比較，IBS-C組盲腸ICD mRNA的表達(dá)差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

與健康對(duì)照比較，*P<0.05

3 討論

ICD是哺乳動(dòng)物乙烯還原酶家族成員之一，屬于核編碼的線(xiàn)粒體黃素酶家族成員，它以可溶性同源四聚體的形式存在于線(xiàn)粒體的基質(zhì)中，由N-末端α螺旋區(qū)域，α β片狀區(qū)域以及另外C-末端的α螺旋區(qū)域組成，涉及脂肪酸β-氧化和亮氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸、加壓素的代謝[6]。ICD在代謝過(guò)程中催化脂酰輔酶A中間產(chǎn)物的α，β脫氫(作用)，在代謝支鏈氨基酸加壓素的代謝中催化異丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化異丁烯酰基輔酶A，在亮氨酸的代謝中催化異戊酰輔酶A的脫氫作用[7]。

ICD的遺傳缺陷導(dǎo)致異戊酸酸血癥，ICD缺乏癥是一種罕見(jiàn)的代謝性疾病，常在兒童期發(fā)病，其發(fā)病與體內(nèi)編碼ICD的基因發(fā)生突變有關(guān)[8]。1998年，Roe等[9]報(bào)道了首例ICD缺乏癥。直到2002年，Nguyen等[10]首次報(bào)道病癥的基礎(chǔ)是在DNA水平的異常。大多數(shù)患者無(wú)癥狀僅在串聯(lián)質(zhì)譜法新生兒篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)此病，常有報(bào)道經(jīng)篩查出的患者沒(méi)有給予任何治療依然無(wú)任何癥狀[11]。蛋白結(jié)構(gòu)和折疊研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的ACAD基因變異導(dǎo)致蛋白錯(cuò)折疊以及不穩(wěn)定[12]。ACADS基因的突變分析揭示了突變R302Q(指的是在成熟蛋白質(zhì)中的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的氨基酸280)的同合子性，使精氨酸被谷氨酰胺所代替，在體外能導(dǎo)致酶失活[10]。R302Q影響FAD輔助因子的作用以及ICD四聚體分子亞單位之間相互作用或FAD與四聚體亞單位間的作用[12]。

本研究通過(guò)Western Blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照組及IBS-C患者結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞均有ICD的表達(dá)，ICD在IBS-C乙狀結(jié)腸表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組的相應(yīng)部位，但I(xiàn)CD在盲腸的表達(dá)差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)熒光定量PCR也進(jìn)一步確認(rèn)了IBS-C組乙狀結(jié)腸的ICD mRNA表達(dá)下調(diào)。結(jié)腸黏膜ICD的表達(dá)下調(diào)提示亮氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸以及加壓素代謝可能異常。ICD除了在先天性代謝性疾病的研究外，有關(guān)ICD與疾病的研究較少，Wollmer等[13]發(fā)現(xiàn)ICD基因多態(tài)性與散發(fā)型Alzheimer’s病有關(guān)。選擇性剪接小鼠編碼ICD的基因可導(dǎo)致線(xiàn)粒體缺陷和引起小鼠肝臟脂肪變性[14]。人肝脂肪變性與ICD的關(guān)系需進(jìn)一步研究證實(shí)。亮氨酸、異亮氨酸及加壓素等支鏈氨基酸對(duì)于正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育尤其重要，IBS結(jié)腸組織中這些氨基酸代謝異常，必然影響結(jié)腸上皮細(xì)胞正常的功能。ICD的表達(dá)減低是否也跟基因突變有關(guān)？是否會(huì)引起其上游代謝產(chǎn)物在結(jié)腸黏膜局部累積，是否存在氨基酸代謝異常，從而導(dǎo)致IBS患者的癥狀？我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)糖代謝相關(guān)酶醛縮酶A在IBS結(jié)腸黏膜表達(dá)異常[15]。兩者是否相互關(guān)聯(lián)？與β-氧化的關(guān)系怎樣？這些問(wèn)題都有待于進(jìn)一步研究。