袁紅剛，李三梅

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)惡性腫瘤中最常見的一種[1]，世界衛(wèi)生組織根據(jù)惡性程度將其分為4級(jí)：Ⅰ-Ⅱ級(jí)為低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤、Ⅲ-Ⅳ級(jí)為高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤[2]，其發(fā)病機(jī)制不明，迄今仍缺乏早期準(zhǔn)確、客觀、系統(tǒng)的診斷指標(biāo)，患者死亡率高、存活期短。因此，進(jìn)一步了解腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，明確影響腦膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)因子，尋找早期的診治手段顯得尤為重要。微小RNA(microRNAs，miRNA)是一類內(nèi)生的，長(zhǎng)度約為18～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA，其參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段[3]。有報(bào)道表明血清中游離miRNA被認(rèn)為是有價(jià)值的腫瘤檢測(cè)指標(biāo)之一[4]。MiR-138是腫瘤中重要的調(diào)控因子，其在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞與組織中低表達(dá)[5]，但其在腦膠質(zhì)瘤患者血清中表達(dá)的變化國(guó)內(nèi)外還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR)方法對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者及健康體檢者血清中miR-138的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，體外實(shí)驗(yàn)分析miR-138表達(dá)變化對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討miR-138在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究所有血清標(biāo)本均來源于湖北省漢川市人民醫(yī)院神經(jīng)外科腦膠質(zhì)瘤確診患者及健康體檢者，并按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行樣本收集，每組各60例，其中所有腦膠質(zhì)瘤患者標(biāo)本采集前均未接受放化療或手術(shù)治療，健康體檢者各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均在正常參考范圍內(nèi)且體格及影像學(xué)檢查均無異常，本研究所有納入患者均已知情且獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。所有血清標(biāo)本收集后均立即置于4℃離心機(jī)中，3 500 r/min離心10 min；分離血清后再置于4 ℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心15 min。將最終獲得的血清置于無RNA酶的Ep管中-80 ℃保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 血清RNA的提取及qRT-PCR檢測(cè) 利用血清miRcute miRNA提取分離試劑盒(DP501，北京天根生化科技有限公司)，按照說明書中的標(biāo)準(zhǔn)操作流程分離提取血清標(biāo)本中的miRNA。以miRNA為模板，通過cDNA合成試劑盒(Thermo Scientific Inc，美國(guó))進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其具體反應(yīng)體系(10 μL)：2 μL總RNA，3 μL超純水，1 μL引物，充分混勻后67 ℃孵育5 min后置于冰上；加入0.5 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，0.5 μL RNase抑制劑，1 μL dNTP以及2 μL逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，充分混勻后按42 ℃ 50 min，80 ℃ 5 min體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。通過Maxima SYBR Green qPCR Kit試劑盒(Thermo Scientific Inc，美國(guó))，采用qRT-PCR的方法對(duì)2組血清樣本中的miR-138的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。其反應(yīng)體系(20 μL)：2 μL cDNA，6 μL超純水，10 μL SYBR Green反應(yīng)緩沖液，1 μL上游引物，1 μL下游引物；反應(yīng)條件如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，73 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。所有檢測(cè)結(jié)果均采用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。反應(yīng)中所使用引物序列設(shè)計(jì)如表1。

表1 miR-138以及內(nèi)參U6引物序列

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。用含10%胎牛血清(中國(guó)NCPC公司)、200 μg/mL鏈霉素(美國(guó)GIBCO公司)和200 U/mL青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基作常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2，室溫37 ℃。miR-138 mimic(AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCGTT)及miR-NC均由美國(guó)Invitrogen生物公司合成。參照Lipofectamine-2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Invitrogen生物公司)分別對(duì)2種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-138 mimic和miR-NC，48 h后參照實(shí)驗(yàn)方法1.2.1測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-138表達(dá)水平的變化。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將分別轉(zhuǎn)染miR-138 mimic及miR-NC的2種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于96孔板中(2×103/孔)，每孔200 μL，作常規(guī)培養(yǎng)。處理后，向第一孔中加入20 μL噻唑藍(lán)溶液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸去上清，加入200 μL二甲基亞砜溶液，振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處檢測(cè)其吸光值并做好記錄。按照上述方法，每24 h監(jiān)測(cè)1次細(xì)胞增殖情況，共計(jì)5次。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用含牛血清白蛋白的培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)到5×105/mL，制備細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液100 μL置于Transwell小室中，并預(yù)先在下層小室中加入適量含有20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，棄去培養(yǎng)液，無鈣磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗，甲醇固定30 min，然后用0.1%的結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色20 min，用棉簽小心擦去小室上層細(xì)胞，再次PBS液沖洗，于顯微鏡下觀察腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移與侵襲。隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(200×)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤患者和健康體檢者血清中miR-138表達(dá)情況 通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者和健康體檢者血清中miR-138表達(dá)，結(jié)果顯示：血清中miR-138表達(dá)水平，與健康體檢者(4.72±0.66)比較，腦膠質(zhì)瘤患者(2.35±1.07)明顯降低(t=14.60，P<0.01)，圖1。隨腦膠質(zhì)瘤患者惡性程度的增加，miR-138表達(dá)量逐漸減少，且低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤與高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者血清miR-138表達(dá)差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.22，P<0.05)，但低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者(Ⅰ與Ⅱ級(jí))以及高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者(Ⅲ與Ⅳ級(jí))之間相互差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t低=0.13，P>0.05；t高=0.38，P>0.05)，表2。

與健康體檢者比較，***P<0.01

表2 不同惡性程度腦膠質(zhì)瘤患者miR-138相對(duì)表達(dá)量

注：與低級(jí)別膠質(zhì)瘤Ⅱ級(jí)比較，*P>0.05，**P<0.05，***P<0.01；與高級(jí)別膠質(zhì)瘤Ⅲ級(jí)比較，△P>0.05，△△P<0.05，△△△P<0.01

2.2 血清miR-138表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤診斷價(jià)值的ROC分析 通過ROC曲線(圖2)評(píng)估血清miR-138診斷腦膠質(zhì)瘤的靈敏度和特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：曲線下區(qū)域面積(area under curve,AUC)為0.75(95%置信區(qū)間為0.65～0.85，P=0.00)；根據(jù)約登指數(shù)確定診斷腦膠質(zhì)瘤的miR-138臨界閾值即截?cái)嘀禐?.19，其診斷腦膠質(zhì)瘤的靈敏度為92%、特異性為52%。提示miR-138作為診斷腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)志物具有較高的診斷效率。

圖2 腦膠質(zhì)瘤患者血清miR-138診斷價(jià)值的ROC曲線

2.3 轉(zhuǎn)染miR-138 mimic與轉(zhuǎn)染miR-NC腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)miR-138表達(dá) 與轉(zhuǎn)染miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-138 mimic的2種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-138表達(dá)水平明顯升高(tA=11.93，P<0.01；tB=10.53，P<0.01)。圖3。

與miR-NC組比較，***P<0.01

2.4 MiR-138高表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 分別將miR-138 mimic或miR-NC轉(zhuǎn)染至2種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其增殖能力的改變，結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-138將明顯抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外增殖能力。圖4。

圖4 MiR-138高表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

2.5 MiR-138高表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響 分別將miR-138 mimic或miR-NC轉(zhuǎn)染至2種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移與侵襲能力變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-138 mimic組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外遷移和侵襲能力均受到明顯抑制。圖5。

與miR-NC組相比，***P<0.01

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是一種源自神經(jīng)上皮的腫瘤，占顱腦腫瘤接近一半。腦膠質(zhì)瘤早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已經(jīng)侵襲至重要功能區(qū)，導(dǎo)致手術(shù)無法完全切除，加上對(duì)放化療效果不明顯，造成腦膠質(zhì)瘤患者，尤其是惡性膠質(zhì)瘤患者生存率非常低，5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌，位列第三位[6]。因此，早期診斷對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的治療及預(yù)后有著非常重要的作用。

MiRNA是非編碼RNA中的成員，近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用，具有極大臨床診斷價(jià)值[7]。Lu等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-573表達(dá)水平的下調(diào)將促進(jìn)胃癌的發(fā)生，可作為一種腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于胃癌的早期診斷；李濤等[9]研究發(fā)現(xiàn)肝癌血清miRNA-200c表達(dá)變化促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展，并與患者預(yù)后相關(guān)；miRNA-141是潛在的前列腺癌早期診斷標(biāo)志物[10]；miRNA-21、miRNA-34a參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，且兩者對(duì)宮頸癌的早期診斷具有一定的預(yù)測(cè)效能等[11]。因此，對(duì)不同腫瘤特異性miRNA的檢測(cè)將有利于腫瘤的早期診斷，從而及時(shí)采取措施來改善腫瘤患者的預(yù)后。

MiR-138是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類具有腫瘤調(diào)控作用的miRNA，在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)[12-13]。因此，miR-138在腫瘤形成過程中通常發(fā)揮抑癌基因的作用。Stojcheva等[14]研究表明，miR-138能通過靶向抑制細(xì)胞凋亡蛋白BIM從而抑制自噬介導(dǎo)替莫唑胺化療對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的耐藥；王震等[5]研究表明miR-138通過下調(diào)hTERT蛋白的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，是新的膠質(zhì)瘤抑癌因子。但是這些研究都集中在細(xì)胞與組織上miR-138表達(dá)的變化，作為腫瘤良好標(biāo)志物檢測(cè)項(xiàng)目的外周血液中miRNA表達(dá)是否變化還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤患者血清miR-138呈現(xiàn)低表達(dá)，且隨著腦膠質(zhì)瘤的惡性程度增加，血清miR-138表達(dá)量逐漸減少。原發(fā)癌組織與血清中miRNA表達(dá)水平具有一致性[15]，既然腦膠質(zhì)瘤患者組織與細(xì)胞miR-138呈現(xiàn)低表達(dá)，那么勢(shì)必導(dǎo)致血清miR-138呈現(xiàn)同樣變化。本研究利用ROC曲線對(duì)腦膠質(zhì)瘤的診斷效率進(jìn)行評(píng)估，AUC為0.75，結(jié)果呈現(xiàn)出較好的診斷效率；通過約登指數(shù)確定最佳截?cái)嘀禐?.19，其診斷腦膠質(zhì)瘤的敏感性和特異性分別為92%和52%。最佳截?cái)嘀档拇_定，為miR-138應(yīng)用于臨床腦膠質(zhì)瘤的診斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-138過表達(dá)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，提示血清miR-138低表達(dá)引起腦膠質(zhì)瘤產(chǎn)生及惡性程度增加可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞增殖和侵襲作用加強(qiáng)所引起的。

腦膠質(zhì)瘤患者血清miR-138表達(dá)下調(diào)與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生及惡性程度有關(guān)，其機(jī)制可能是因?yàn)槟X膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲作用加強(qiáng)。血清miR-138測(cè)定有望成為診斷腦膠質(zhì)瘤的分子生物標(biāo)志物及特異性治療的靶點(diǎn)，其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。