陳 玲，黃彥捷，周瑾艷，吳向壘，黃敏晗，許俊斌，羅旭東

(廣東省計量科學研究院 廣東省現(xiàn)代幾何與力學計量技術重點實驗室，廣東 廣州 510405)

1 引 言

科研和檢測領域常用菌落計數(shù)器檢驗食品、衛(wèi)生用品、臨床標本中細菌數(shù)量，需要標準物質對其測量結果的一致性、準確性及可比性進行評價。然而菌落本身是不穩(wěn)定的，不方便攜帶，不適合用作菌落計數(shù)器計量校準用標準物質。

菌落是指在固體培養(yǎng)基上生長，可以用肉眼識別的，由成千上萬相同的細菌組成的生長物。菌落的大小和形態(tài)和菌種息息相關。當樣品被稀釋到一定程度并與培養(yǎng)基混合，在一定的培養(yǎng)條件下，每一個能夠生長繁殖的細菌細胞都能在培養(yǎng)基上形成可見的菌落[1]。菌落總數(shù)就是指在一定條件下每克(每毫升)樣品生長出的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)測定可以用來判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質量，反映了食品在生產過程中是否符合衛(wèi)生要求[2,3]。菌落數(shù)量、大小和形態(tài)標志著食品衛(wèi)生質量的優(yōu)劣[4，5]。

在日常檢驗和科研領域，通常使用光學顯微鏡或是菌落計數(shù)器對菌落的大小、形態(tài)、邊緣、表面、質地、顏色等性質進行分析[6,7]。其中菌落計數(shù)器廣泛用于食品、衛(wèi)生用品、臨床標本中細菌數(shù)量的檢驗。目前該儀器在各級衛(wèi)生防疫站、環(huán)境檢測站、食品衛(wèi)生監(jiān)督檢查所、化妝品和藥品檢驗實驗室、醫(yī)院、大專院校及科研單位中被用于微生物菌落計數(shù)、抗生素抗菌性測試和菌種篩選等;然而在廣泛的應用背景下，各儀器之間測量結果是否一致、可比，是否可以實現(xiàn)量值溯源就很大程度上影響到了儀器測量結果的有效性、可靠性和準確性，因此亟需通過穩(wěn)定可溯源的標準物質實現(xiàn)對各類菌落計數(shù)器的計量校準[8～12]。

但是由于真實菌落的體系復雜、穩(wěn)定性差，很難用來做標準物質進行量值溯源傳遞和分析方法評價。現(xiàn)有的評價方法往往不盡如人意。吳玉峰等[13]選取兩位長期從事微生物檢驗工作的專業(yè)人員采用雙盲法對水樣中的菌落總數(shù)計數(shù)，取兩人計數(shù)值的平均數(shù)，與該儀器分析結果進行對比驗證;利用該方法，雖然每次可以通過平板計數(shù)法人工計數(shù)來驗證菌落計數(shù)器測量的準確性，但無法評價儀器精密度，且存在人為因素所產生的偏差。張春晨等[14]則采用枯黑芽孢制備菌片管，隨意抽取10%的樣品進行檢測，制作質控圖；但由于枯黑芽孢是生物活體，其菌落本身不穩(wěn)定，且不便攜帶，不適合做菌落計數(shù)器的質控物。

根據菌落計數(shù)器的應用，結合菌落的培養(yǎng)生長特性，借鑒計算機圖像法設計[15]，采用功能等效的模擬菌落作為標準物質，就可以實現(xiàn)菌落計數(shù)器的精確校準、分析方法的有效評價以及分析質量的精密控制。本文報道的模擬菌落標準物質(bacterial colony by plane)包括了用于校準菌落計數(shù)器示值誤差和示值重復性的模擬菌落總數(shù)的標準物質和一種用于校準菌落計數(shù)器鑒別力的模擬菌落大小的標準物質。模擬菌落總數(shù)標準物質有4種，分別為36 CFU、120 CFU、180 CFU和290 CFU(CFU是colony-forming units的縮寫，菌落形成單位，指單位體積中的細菌群落總數(shù))。模擬菌落大小的標準物質用影像測量儀進行了準確定值，擴展不確定度為0.024 mm。

本文系統(tǒng)地介紹了標準物質原材料的選擇、特性量值的測量方法、標準物質的制備方法、均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察以及定值過程[16];對模擬菌落標準物質的穩(wěn)定性進行了12個月的考察，證明該標準物質是穩(wěn)定的。該系列標準物質量值準確，均勻性、穩(wěn)定性良好，使用方便，已通過國家二級標準物質評審，編號為GBW(E)130586～GBW(E)130590，有望作為量值傳遞的標準在生物、食品分析評價領域發(fā)揮重要的作用。

2 實驗部分

2.1 儀器

Prismo Navigator 795 HTG影像測量機。影像測量機在使用前，首先用3等3級量塊和物鏡測微尺對所使用的儀器進行檢定，確認儀器處在正常的工作狀態(tài)，并保證儀器測量的溯源性。

2.2 標準物質的制備

2.2.1 圖案設計

采用AutoCAD設計，根據實際使用情況，設計相應的菌落模擬圖形。將模擬菌落最終成像在直徑為9 cm的膜片上。實際制作時，每批標準物質，每個圖形都成像500片，即每種標準物質制作500份。

2.2.2 結構設計

使用高分辨率光繪機在感光膠片上根據模擬菌落圖形進行曝光制作。采用高透光聚碳酸酯(PC)材料印刷銀鹽，構成模擬菌落標準物質的膜片。膜片包括保護層、影像層、粘結層、片基、防光暈層和防靜電層(結構如圖1所示)。

其中保護層含有紫外線吸收劑，為明膠薄膜，用于防止影像層所承載信息受光照而褪色以及保護影像層免于劃傷；影像層表面設有多個不透明斑點，不透明斑點采用銀鹽印刷技術固著于影像層表面，以斑點模擬菌落；影像層與片基通過粘結層相互粘連；片基為高透光透明的聚碳酸酯材料，作為校準裝置的載體基材；防光暈層由吸光物質、粘合劑組成，能吸收產生光暈的有害光線；防靜電層中含有防靜電劑以避免靜電聚集。

2.3 標準物質樣品定值

共選取2種特征量值對菌落進行生物等效性模擬，分別為菌落總數(shù)及菌落大小。

2.3.1 模擬菌落總數(shù)標準物質的定值

采用人工識別計數(shù)的方法，計數(shù)結果即為標準值。為消除測量時的個人差異，由實驗室6名實驗人員對3個膜片樣品進行計數(shù)，取平均值為定值結果。計數(shù)時，將小的菌落放在視線的左上方;同時，為避免設計值的主導，應使實驗人員保持對設計值的未知狀態(tài)。

2.3.2 模擬菌落大小標準物質的定值

隨機抽取10個膜片樣品，每個樣品采用影像測量機直接進行測量，每個樣品測量3次，剔除異常值后，取10個樣品測量結果的平均值為最終定值結果。

2.4 均勻性檢驗

標準物質的均勻性是衡量標準物質性能的一個重要指標，也是標準物質量值能準確傳遞的物質基礎。隨機抽取一定數(shù)量的樣品，采用精密度高的實驗方法進行測定;采用方差分析法來統(tǒng)計檢驗樣品的均勻性;該方法是通過組間方差和組內方差的比較來判斷各組測量值之間有無系統(tǒng)性差異，如果二者的比小于統(tǒng)計檢驗的臨界值，則認為樣品是均勻的。

2.5 穩(wěn)定性檢驗

標準物質的穩(wěn)定性是指被定值的特性量隨時間變化的情況，標準物質的穩(wěn)定性受物理、化學和保存條件等因素的影響。需要用精密度高的分析方法對其進行長時間的定期考察來確定相對的穩(wěn)定期限。依據標準物質技術規(guī)范，本著前緊后疏的原則，對模擬菌落標準物質的穩(wěn)定性進行了考察。每次隨機抽取3個樣品，每個樣品上進行菌落總數(shù)計數(shù)或是取6個大小一致的菌落，在不同的時間間隔內進行比對測量,各量值測量3次取其平均值進行穩(wěn)定性分析。

3 模擬菌落總數(shù)標準物質

通過等效性模擬菌落標準物質的兩個重要參數(shù)為菌落總數(shù)和菌落大小，運用菌落計數(shù)器可以實現(xiàn)菌落數(shù)量的統(tǒng)計以及菌落大小的觀測。

3.1 圖形設計

依據GB 4789.2—2016《食品微生物菌落總數(shù)的測定》，一般選取30～300 CFU之間的平板進行菌落計數(shù)[17]，設計了模擬菌落總數(shù)分別為36 CFU、120 CFU、180 CFU和290 CFU的4種菌落總數(shù)標準物質，其圖案如圖2所示。其中，模擬菌落總數(shù)標準值為36 CFU和120 CFU的2種標準物質被設計為均勻大小，代表菌落均勻分布，大小基本一致，約為3.180 mm?？紤]到實際檢測中會碰到菌落大小不一并出現(xiàn)粘連的情況，因而設計的模擬菌落總數(shù)標準值為180 CFU和290 CFU的2種標準物質，其菌落大小不一，分布不均勻，且模擬了典型的粘連情況。其中180 CFU標準物質的菌落直徑范圍為0.482～4.189 mm，290 CFU標準物質的菌落直徑范圍為0.407～3.193 mm。

圖2 模擬菌落總數(shù)標準物質俯視圖Fig.2 Top view of the simulated bacterial colony counts reference materials

3.2 菌落總數(shù)的定值

由于設計的模擬菌落總數(shù)標準物質有良好的保護層，加工過程中也不會對模擬菌落個數(shù)產生影響,因而利用膜片設計的菌落總數(shù)均和每次實驗人員計數(shù)結果相一致，均為設計值，分別為36 CFU、120 CFU、180 CFU和290 CFU。

3.3 均勻性及穩(wěn)定性檢驗

當分別從每種已經編上號碼的菌落總數(shù)標準物質中按照頭尾、中間編號隨機抽取15個樣品，目測識別計數(shù)時，模擬菌落總數(shù)計數(shù)也為設計值，說明該系列標準物質均勻性良好。

當每次隨機抽取3個樣品，在不同的時間間隔內進行比對測量，發(fā)現(xiàn)在長達12個月的觀察時間內，模擬菌落總數(shù)計數(shù)均為設計值，說明該系列標準物質穩(wěn)定性良好。

3.4 不確定度分析及最終定值

根據JJG 1006—94《一級標準物質技術規(guī)范》的規(guī)定[18]，標準值的總不確定度由3部分組成: 第1部分為定值的標準不確定度分量ud，第2部分是不均勻產生的不確定度分量uj，和第3部分不穩(wěn)定產生的不確定度分量uw。

根據模擬菌落總數(shù)的定值數(shù)據，不同實驗人員得到的定值數(shù)據是一致的。均勻性和穩(wěn)定性考察結果表明，2種實驗條件下引入的不確定度分量可以忽略不計。但在使用過程中，可能由于使用磨損導致標準物質中直徑較小的標準物質識別不清，導致總數(shù)減少; 或者標準物質的拉劃損壞導致上機識別計數(shù)時菌落總數(shù)增加。

以總數(shù)為180 CFU的模擬菌落總數(shù)標準物質為例，磨損可能導致最小的1個菌落計數(shù)時模糊，故由此引入的不確定度為：

因此，模擬菌落總數(shù)標準物質的相對擴展不確定度為：

Urel=0.55%×2=1.1%

4種模擬菌落總數(shù)標準物質的最終定值結果為：

36 CFU:Urel=1%,k=2；

120 CFU:Urel=2%,k=2；

180 CFU:Urel=2%,k=2；

290 CFU:Urel=2%,k=2。

3.5 實際應用

該系列模擬菌落總數(shù)標準物質已獲得國家二級標準物質認證，編號為GBW(E)130586～GBW(E)130589，并且已經應用到了檢測和科研領域菌落計數(shù)器的實際校準當中。圖3是利用模擬菌落總數(shù)為180 CFU的菌落總數(shù)標準物質對某品牌菌落計數(shù)器校準時的成像結果，儀器可以識別所有模擬菌落，實現(xiàn)對計數(shù)結果的準確評估。

圖3 模擬菌落總數(shù)標準物質用于儀器校準結果Fig.3 The result of calibration using the simulated bacterial colony counts reference materials

4 模擬菌落大小標準物質

4.1 圖形設計

根據市面上常見的菌落計數(shù)儀示值分辨力一般不大于0.4 mm，即可以識別最小菌落的直徑不超過0.4 mm，設計了圖案如圖4所示的模擬菌落大小的標準物質，模擬菌落總數(shù)為120 CFU，圖案中包含了0.1～5.0mm直徑范圍的模擬菌落，也涉及到了常見的2個或多個菌落的粘連情況模擬。利用影像測量儀進行了精確直徑定值，特性值如表1所示。需要說明的是圖4中菌落的位置與表1中的數(shù)值一一對應，表1中以從上端開始的各行中的左數(shù)位號表示，如3-1表示第3行中左數(shù)第1個模擬菌落，4-6表示第4行中左數(shù)第6個模擬菌落。

圖4 模擬菌落大小標準物質俯視圖Fig.4 Top view of the simulated bacterial colony sizes reference materials

4.2 菌落大小的定值

由于設計的模擬菌落總數(shù)標準物質有良好的保護層，加工過程中也不會對模擬菌落大小產生影響,因而菌落大小尺寸均接近設計值，共含有120種不同直徑的菌落，具體結果見表1。

在均勻性、穩(wěn)定性及不確定度分析時，為簡明起見，將以模擬菌落的1個代表性尺寸的分析為例來說明。

4.3 均勻性檢驗

從已編號的500份標準物質中按照頭尾、中間編號隨機抽取15個樣品，以大小為2.681 mm(6-2位置)的模擬菌落為代表;用影像測量機進行定值測量，每個菌落測量3次，取平均值作為均勻性評價的測量結果。測定結果如表2所示。

表1 模擬菌落大小標準物質特性量值及標準偏差Tab.1 The value and standard deviation of the reference materials stimulated bacterial colony sizes mm

表2 模擬菌落大小標準物質均勻性檢驗Tab.2 The homogeneity of the simulated bacterial colony sizes reference materials mm

95%的置信概率下采用方差分析考察樣品的均勻性[19,20]，計算結果表3所示。表中：SS為標準方差；df為自由度；MS為平均方差；F為F值；Sig.F為F的臨界值。由表3中數(shù)據可得：

Sig.F=Fα(14,30)=2.04,α=0.05

(1)

F

表3模擬菌落大小標準物質均勻性結果方差分析
Tab.3The Homogeneity and variance analysis results of the simulated bacterial colony sizes reference materials

差異源SSdfMSFSig.F組間2.91×10-4142.08×10-51.512.04組內4.14×10-4301.38×10-5總計7.05×10-444

均勻性產生的標準偏差SH可由式(2)和式(3)求得。

=2.333×10-6

(2)

(3)

4.4 穩(wěn)定性檢驗

每次隨機抽取3個樣品，每個樣品上取6個大小一致的菌落，在不同的時間間隔內進行比對測量，仍舊以大小為2.681 mm(6-2位置)的模擬菌落為代表，測量3次取平均值進行穩(wěn)定性分析，具體數(shù)據如表4所示。因沒有一種物理/化學模型能夠真實地描述該候選標準樣品的穩(wěn)定性變化機理，故采用直線作為經驗模型。

將表4中數(shù)據，以x代表時間，以y代表菌落直徑，擬合成一條直線，利用評估最后的回歸方差來判斷樣品的穩(wěn)定性。

表4 模擬菌落大小標準物質穩(wěn)定性實驗Tab.4 The stability of the simulated bacterial colony sizes reference materials mm

由分析數(shù)據得到線性模型的斜率為：

(4)

則線性方程的標準偏差：

(5)

S=4.59×10-3，則斜率的不確定度：

(6)

在自由度為n-2和p=0.95(95%置信水平)時，查表得t因子等于2.75

t0.95,n-2·S(b1)=2.75×4.75×10-4

=1.31×10-3

(7)

經計算可得|b1|

4.5 不確定度分析

模擬菌落大小的不確定度來源包括定值引入的不確定度、均勻性引入的不確定度、穩(wěn)定性引入的不確定度以及溫度變化引入的不確定度。

4.5.1 定值引入的不確定度

定值采用影像測量儀，故模擬菌落直徑定值不確定度來源包括影像測量儀測量引入的不確定度和儀器測量重復性引入的不確定度。

影像測量儀的測量不確定度：一是平臺移動的示值誤差引入的不確定度，二是鏡頭誤差引入的不確定度。平臺移動誤差根據儀器的校準為±1 μm，引入的不確定度為

鏡頭誤差引入的不確定度包含尺寸測量誤差即長度測量誤差引入的不確定度和圓度測量誤差即鏡頭的畸變引入的測量不確定度。

尺寸測量誤差根據校準證書為±1.5 μm，由此引入的不確定度為：

合成上述不確定度分量，由影像測量儀測量引入的不確定度為：

=0.001 4 mm

(8)

重復測量10次大小為2.681 mm的模擬菌落尺寸，測量值分別為：2.6759 mm，2.6813 mm，2.6864 mm，2.6843 mm，2.6817 mm，2.6784 mm，2.6773 mm，2.6718 mm，2.6738 mm，2.6809 mm。10次測量值的標準偏差為0.004946mm，則示值重復性引入的不確定度為：

定值引入的不確定度為：

=3.13×10-3mm

(9)

4.5.2 均勻性產生的標準不確定度

根據均勻性檢驗部分的計算結果看，不均勻性所產生的標準偏差需要合成到定值最終不確定度中。故樣品間不均勻的標準偏差：

uj=SH=1.53×10-3mm

(10)

4.5.3 穩(wěn)定性引入的不確定度

采用評估穩(wěn)定性的回歸方差分析表來進行估計標準不確定度。有效期t為 12個月的長期穩(wěn)定性的不確定度貢獻為：

uw=S(b1)·t=0.000 475×12 mm

=5.70×10-3mm

(11)

4.5.4 溫度變化引入的不確定度

塑料的膨脹系數(shù)為1.8×10-4mm/K，存放或運輸環(huán)境溫度變化為±20 ℃，因此溫度變化引入的不確定度分別為：uT=2.681×1.8×10-4×20 mm=9.65×10-3mm。

4.5.5 合成不確定度

=[(3.13×10-3)2+(1.53×10-3)2+

(5.70×10-3)2+(9.65×10-3)2]1/2mm

=1.17×10-2mm

(12)

取k=2，按不確定度計算中的最大值，則擴展不確定度為:U=1.17×10-2×2 mm≈0.024 mm。其余119個模擬菌落的不確定度也包含上述4種不確定度分量，計算過程就不在本文中敘述。該模擬菌落大小標準物質已獲得國家二級標準物質認證，編號為GBW(E)130590，具體參數(shù)可查詢相應標準物質證書。

4.6 實際應用

該模擬菌落大小標準物質也已經應用到了檢測、科研領域菌落計數(shù)器的實際校準當中。圖5是利用該標準物質對某品牌菌落計數(shù)器校準時的成像結果，利用儀器對不同大小的模擬菌落均可進行識別分析，進而實現(xiàn)了對儀器示值誤差和示值分辨力的準確評估。

圖5 模擬菌落大小標準物質用于儀器校準結果Fig.5 The result of calibration using the simulated bacterial colony sizes reference materials

5 結 論

基于對菌落等效性模擬的思路，采用AutoCAD設計模擬菌落的圖像，并成像在直徑為9 cm處理的高透光聚碳酸酯(PC)膜片上，添加防靜電、光暈和刮劃傷保護層，制備了一系列模擬菌落標準物質，并進行了均勻性、穩(wěn)定性考察及不確定評估。

(1)對模擬菌落總數(shù)標準物質，采用人工計數(shù)的方法得到標準值，不同的人員可以得到穩(wěn)定一致的總數(shù)值，穩(wěn)定性和均勻性良好。

(2)對模擬菌落大小標準物質，采用影像測量儀測量定值，進行了均勻性和穩(wěn)定性考察，并準確分析了每一個模擬菌落的直徑不確定度。

對該系列模擬菌落標準物質進行了開發(fā)，目前，該系列模擬標準物質已經得到實際應用，并獲得滿意結果。該系列標準物質可用于菌落計數(shù)器的校準、分析方法評價等方面，有望在食品安全、生物監(jiān)測領域發(fā)揮重要作用。