李仰平， 張玲玲,2??， 李若佼， 劉 甜， 郭振義， 李婉茹， 包振民,2

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

DNA 甲基化，即胞嘧啶的5號(hào)碳原子上連接的氫原子被替換成為一個(gè)甲基，是真核生物類(lèi)群中的重要的表觀遺傳修飾，廣泛存在于植物，動(dòng)物和真菌中。DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控，基因組穩(wěn)定性維持，哺乳動(dòng)物X染色體失活等生物學(xué)現(xiàn)象中起到十分重要的作用[1-2]。在生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞的DNA甲基化水平并不是一成不變的，在哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育中就存在兩次大規(guī)模的DNA甲基化的重編程過(guò)程[3]。第一次DNA甲基化的重編程發(fā)生在配子發(fā)生過(guò)程中，原始生殖細(xì)胞首先去除來(lái)源于外胚層的DNA甲基化模式，在形成精子和卵子的過(guò)程中，分別形成配子特異的DNA甲基化模式，這種DNA甲基化模式與配子內(nèi)基因表達(dá)，精子DNA的包裝以及基因印跡有著密切關(guān)系[4-6]。第二次DNA甲基化的重編程發(fā)生在精卵結(jié)合之后，精子來(lái)源的DNA會(huì)迅速發(fā)生DNA去甲基化，在受精卵第一次分裂之前精子來(lái)源的DNA去甲基化就已經(jīng)完成；在隨后的細(xì)胞分裂過(guò)程中，卵子來(lái)源的DNA會(huì)逐漸去甲基化，在囊胚時(shí)期達(dá)到DNA甲基化的最低水平。早期發(fā)育時(shí)期DNA的去甲基化對(duì)胚胎細(xì)胞的全能性具有重要意義[3]。

DNA甲基化的重編程包括DNA的去甲基化和重新甲基化，其中DNA的去甲基化過(guò)程分為兩種類(lèi)型：第一種是DNA的被動(dòng)去甲基化，在細(xì)胞分裂的過(guò)程中，隨著DNA的復(fù)制，如果不形成新的DNA甲基化，DNA的甲基化水平就會(huì)逐漸降低，如胚胎時(shí)期卵子來(lái)源DNA的去甲基化現(xiàn)象。第二種是DNA的主動(dòng)去甲基化，即在不發(fā)生DNA復(fù)制的情況下，通過(guò)一系列反應(yīng)脫去胞嘧啶五號(hào)碳原子上所連接的甲基基團(tuán)的過(guò)程[7]。該過(guò)程主要由TET(ten-eleven translocation)蛋白催化，TET先將5甲基胞嘧啶5mC催化生成5羥甲基胞嘧啶5hmC[8],然后脫氫生成5甲?；奏?fC，并可進(jìn)一步氧化形成5羧基胞嘧啶5caC[9]。5fC和5caC都可以被胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)識(shí)別并脫去對(duì)應(yīng)的甲?；汪然箟A基恢復(fù)為沒(méi)有修飾的胞嘧啶，從而完成DNA的主動(dòng)去甲基化過(guò)程[10]。在哺乳動(dòng)物中，TET基因家族有三個(gè)成員TET1，TET2和TET3，它們分別在不同的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮DNA去甲基化的功能。TET3基因在卵和受精卵中表達(dá)量較高，缺失TET3基因會(huì)導(dǎo)致早期胚胎中的5hmC含量下降，表明TET3蛋白可能參與受精卵中父本來(lái)源DNA的去甲基化[11-12]。TET1和TET2基因在小鼠的原始生殖細(xì)胞中檢測(cè)到表達(dá)[13]，小鼠中的基因敲除實(shí)驗(yàn)也表明這兩個(gè)基因?qū)ε渥影l(fā)生過(guò)程中基因印跡的擦除具有重要作用，并且TET1和TET2蛋白分別作用于不同的目標(biāo)基因[14-15]。

蝦夷扇貝是中國(guó)重要的冷水性養(yǎng)殖貝類(lèi)，開(kāi)展對(duì)其科學(xué)、有效的育種和養(yǎng)殖工作是水產(chǎn)領(lǐng)域的重點(diǎn)工作之一。對(duì)蝦夷扇貝功能基因，包括生長(zhǎng)[16]、生殖[17]和免疫[18]相關(guān)基因的研究是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，并在近年來(lái)得到了一系列成果。特別最近蝦夷扇貝基因組的完成[19]，更是大大推動(dòng)了蝦夷扇貝功能基因的研究。蝦夷扇貝每年經(jīng)歷一個(gè)生殖周期，包括休止期，增殖期，生長(zhǎng)期和成熟期四個(gè)時(shí)期[20]。筆者近期結(jié)合DNA甲基化水平和DNMT基因家族的表達(dá)模式，分析了蝦夷扇貝配子發(fā)生和早期發(fā)育過(guò)程中DNA甲基化的產(chǎn)生和維持[21]。本研究將從DNA去甲基化酶TET的角度，進(jìn)一步探討蝦夷扇貝配子發(fā)生和早期發(fā)育中DNA去甲基化過(guò)程的發(fā)生。

1 材料方法

1.1 蝦夷扇貝TET基因的鑒定

人(Hs),小鼠(Mm),野豬(Ss),牛(Bt),美洲河貍(Cc),單峰駝(Cd)，原鴿(Cl),安氏蜂鳥(niǎo)(Ca)，鬃獅蜥(Pv),海龜(Cm)，非洲爪蟾(Xl),斑馬魚(yú)(Dr),青鳉(Nf),菜粉蝶(Pr),果蠅(Dm),太平洋牡蠣(Cg),美洲牡蠣(Cv),紫貽貝(Mg),帽貝(Lg)的TET蛋白序列下載自NCBI和Uniprot，其Accession Number見(jiàn)表1。用SMART在線軟件(http://smart.emblheidelberg.de/)預(yù)測(cè)這些蛋白的結(jié)構(gòu)域。用blast軟件將這些TET蛋白的保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)到蝦夷扇貝的蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank assembly accession: GCA_002113885.2)，比對(duì)參數(shù)為“blastall -p blastp -a 16 -v 10 -b 20 -e 1e-6”，獲得蝦夷扇貝候選TET基因，并用SMART預(yù)測(cè)蝦夷扇貝TET蛋白的結(jié)構(gòu)域。用ClustalX使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的比對(duì)，確定蝦夷扇貝TET蛋白序列中的保守殘基。使用TET蛋白全長(zhǎng)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，先用Protest預(yù)測(cè)出合適的氨基酸替換模型和參數(shù)(-m JTT+I+G+F -v 0.034 -a 1.414)，然后用PhyML軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

表1 各物種TET蛋白的序列信息

續(xù)表1

蛋白名稱(chēng)Protein nameNCBI序列登記號(hào)Accession number物種(拉丁名)Species(Latin name)DrTET3A2CEA2斑馬魚(yú)(D. rerio)PyTETXP_021358783.1蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)CgTETEKC18772.1太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)CvTETXP_022313682.1美洲牡蠣(Crassostrea virginica)MgTETOPL33190.1紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)LgTETXP_009060167.1帽貝(Lottia gigantea)DmTETNP_001246581.1果蠅(Drosophila melanogaster)NfTET1SBP47229.1青鳉(Nothobranchius furzeri)NfTET2SBP49038.1青鳉(N. furzeri)NfTET3SBP57161.1青鳉(N. furzeri)SsTET1AGI96745.1野豬(Sus scrofa)SsTET3AGI96747.1野豬(S. scrofa)BtTET2DAA28907.1牛(Bos taurus)PvTET1XP_020663651.1鬃獅蜥(Pogona vitticeps)PvTET2XP_020652070.1鬃獅蜥(P. vitticeps)PvTET3XP_020635782.1鬃獅蜥(P. vitticeps)CcTET1XP_020033190.1美洲河貍(Castor canadensis)CcTET2JAV39811.1美洲河貍(C. canadensis)CcTET3XP_020022002.1美洲河貍(C. canadensis)CdTET1XP_010984118.1單峰駝(Camelus dromedarius)CdTET2XP_010978962.1單峰駝(C. dromedarius)CdTET3XP_010987233.1單峰駝(C. dromedarius)CaTET1XP_008495875.1安氏蜂鳥(niǎo)(Calypte anna)CaTET2KFO97013.1安氏蜂鳥(niǎo)(C. anna)CaTET3XP_008498963.1安氏蜂鳥(niǎo)(C. anna)CmTET1XP_007054709.1海龜(Chelonia mydas)CmTET2XP_007054451.1海龜(C. mydas)CmTET3XP_007067519.1海龜(C. mydas)PrTETXP_022115477.1菜粉蝶(Pieris rapae)

1.2 蝦夷扇貝TET基因的表達(dá)模式

本研究中蝦夷扇貝TET基因的表達(dá)量由RNA-Seq數(shù)據(jù)計(jì)算得到。其中，配子發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室前期工作[22]。首先通過(guò)石蠟切片鑒定獲得休止期、增殖期、生長(zhǎng)期和成熟期的精巢和卵巢，用異硫氰酸胍法提取性腺組織總RNA，然后使用VAHTS stranded mRNA-seq library prep kit for Illumina試劑盒構(gòu)建RNA-Seq文庫(kù)并測(cè)序。早期發(fā)育時(shí)期的表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自蝦夷扇貝基因組文章[19]，包括2～8細(xì)胞期、囊胚、原腸胚、擔(dān)輪幼蟲(chóng)、D型幼蟲(chóng)、早期殼頂幼蟲(chóng)、中期殼頂幼蟲(chóng)、后期殼頂幼蟲(chóng)和稚貝的RNA-Seq數(shù)據(jù)。

表達(dá)量計(jì)算方法如下：先用STAR將RNA-Seq數(shù)據(jù)比對(duì)到蝦夷扇貝基因組[23]，之后用HTSeq-count統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因上覆蓋的reads數(shù)[24]，基因的表達(dá)量(TPM)通過(guò)自行編寫(xiě)的perl腳本計(jì)算獲得。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用單因素方差分析檢測(cè)各性腺發(fā)育時(shí)期之間TET基因的表達(dá)差異。用t檢驗(yàn)進(jìn)行同一時(shí)期兩種性別的基因差異表達(dá)分析。P值小于0.05視為差異顯著。

1.4 組織原位雜交

為探究蝦夷扇貝性腺中表達(dá)PyTET基因的細(xì)胞類(lèi)型，本研究開(kāi)展了原位雜交實(shí)驗(yàn)。用含有Sp6啟動(dòng)子序列的正向引物和含有T7啟動(dòng)子序列的反向引物擴(kuò)增cDNA片段，以純化后的PCR產(chǎn)物為模板，分別用Sp6和T7聚合酶合成地高辛標(biāo)記的正義探針和反義探針。原位雜交引物序列見(jiàn)表2。

將性腺組織切片在PBST(磷酸鹽緩沖鹽水，0.1% Tween-20)中連續(xù)再水化，并用2 μg/mL蛋白酶K在37 ℃下消化15 min。60 ℃預(yù)雜交4 h后，再用含1 μg/mL變性RNA探針的雜交緩沖液(50%甲酰胺，5×SSC，100 μg/mL酵母tRNA，1.5%封閉試劑，0.1% Tween-20)在60 ℃條件下雜交16 h。然后洗去探針，并在含有地高辛抗體的封閉緩沖液(1∶2 000稀釋)中4 ℃孵育16 h。用馬來(lái)酸緩沖液(0.1 mol/L馬來(lái)酸，0.15 mol/L NaCl，0.1% Tween-20，pH=7.5)充分洗滌后，將切片置于NBT/BCIP顯色液中避光顯色，最后用1%中性紅溶液復(fù)染觀察。

表2 原位雜交引物序列

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1蝦夷扇貝TET基因的鑒定

用其他物種TET蛋白的加氧酶結(jié)構(gòu)域比對(duì)到蝦夷扇貝蛋白組，發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝中存在一個(gè)TET同源蛋白，命名為PyTET。該蛋白由1 591個(gè)氨基酸組成，分子量為175 668 Do，等電點(diǎn)為8.57。PyTET基因由10個(gè)外顯子組成，其基因結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示PyTET包含一個(gè)完整的2OGFeDO超家族的加氧酶結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖1)，該結(jié)構(gòu)域與其他物種TET蛋白同源序列的相似度為46.59%～74.85%，并且和其他物種TET蛋白一樣，PyTET的保守結(jié)構(gòu)域中包含鐵離子結(jié)合位點(diǎn)和2-氧代戊二酸結(jié)合殘基(見(jiàn)圖2)。TET蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，PyTET與軟體動(dòng)物TET聚在一起，然后與節(jié)肢動(dòng)物(果蠅和菜粉蝶)TET聚在一起，最后和脊椎動(dòng)物的3個(gè)TET聚在一起(見(jiàn)圖3)。

(藍(lán)色表示編碼區(qū)，灰色表示非翻譯區(qū)，深綠色代表2OGFeDO超家族的加氧酶結(jié)構(gòu)域。The blue and grey regions represent CDS and UTR, respectively. The oxygenase domain of the 2OGFeDO superfamily is highlighted in deep green. )

( 代表鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，●代表2-氧代戊二酸結(jié)合殘基。 for iron ion binding site, ● for 2-oxoglutarate binding residues.)

圖3 TET蛋白的系統(tǒng)發(fā)生分析

2.2 PyTET基因在配子發(fā)生和早期發(fā)育中的表達(dá)模式

PyTET在精巢和卵巢中的表達(dá)呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)。如圖4所示，在精巢中，從休止期到成熟期，PyTET基因的表達(dá)量呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)，在休止期最高，成熟期最低，休止期和增殖期的表達(dá)量顯著高于成熟期。原位雜交結(jié)果表明，PyTET基因在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞中均有表達(dá)(見(jiàn)圖5a)。在卵巢中，PyTET基因在增殖期表達(dá)量最高，在生長(zhǎng)期的表達(dá)量顯著高于休止期。原位雜交結(jié)果表明，PyTET基因主要在卵母細(xì)胞中表達(dá)，在卵原細(xì)胞中有微弱表達(dá)(見(jiàn)圖5b)。

PyTET基因在早期發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量如圖6所示，在多細(xì)胞期PyTET基因的表達(dá)量接近0，隨后表達(dá)量急劇升高，在囊胚期達(dá)到峰值；從原腸胚到D型幼蟲(chóng)期表達(dá)量較低且趨于穩(wěn)定；進(jìn)入殼頂期后PyTET基因表達(dá)量又開(kāi)始逐漸下降，直至中期殼頂幼蟲(chóng)；之后表達(dá)無(wú)明顯變化，一直維持到稚貝。

(不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Different letters indicate significant differences (P<0.05).)

(a) PyTET在精巢中的定位；(b) PyTET在卵巢中的定位。(Sg：精原細(xì)胞；Sc：精母細(xì)胞；Og：卵原細(xì)胞；Oc：卵母細(xì)胞。(a) Localization of PyTET with an anti-sense probe in testes; (b) Localization of PyTET with an anti-sense probe in ovaries. Sg, spermatogonium; Sc, spermatocyte; Og, oogonium; Oc, oocyte.)

(基因表達(dá)量采用衡量指標(biāo)為T(mén)PM。The measure of gene expression level TPM.)

3 討論

DNA甲基化現(xiàn)象廣泛存在于真核生物的各個(gè)類(lèi)群，并在真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，因此DNA甲基化水平的調(diào)節(jié)對(duì)真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育十分關(guān)鍵。DNA甲基化水平的變化包括DNA去甲基化，DNA從頭甲基化，DNA甲基化的維持等過(guò)程，每個(gè)過(guò)程都有相應(yīng)的酶發(fā)揮功能。在哺乳動(dòng)物中，DNMT1/2/3[25-26]和TET/1/2/3[8, 11, 27]都已經(jīng)被鑒定，對(duì)它們的功能也做了比較深入的研究。但在海洋軟體動(dòng)物中，只有少數(shù)生物的DNMT基因被報(bào)道[28]，還未見(jiàn)關(guān)于TET基因的研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)蝦夷扇貝只存在一個(gè)TET的同源基因，與蛻皮動(dòng)物和其它冠輪動(dòng)物類(lèi)似。而脊椎動(dòng)物基因組大多含有3個(gè)TET基因，各成員間的功能有所不同，TET1和TET2參與配子發(fā)生過(guò)程中的DNA去甲基化[13]，TET3參與胚胎發(fā)育過(guò)程中的DNA去甲基化[11-12]。PyTET基因在配子發(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程中都有明顯的表達(dá)量變化，提示PyTET蛋白可能同時(shí)參與兩個(gè)發(fā)育過(guò)程中DNA的去甲基化。以上結(jié)果暗示，PyTET可能接近于TET基因家族的祖先形式，并同時(shí)具有脊椎動(dòng)物不同TET蛋白的功能。

配子發(fā)生過(guò)程中DNA甲基化模式的重建包括DNA去甲基化和重新甲基化的兩個(gè)過(guò)程，在哺乳動(dòng)物研究的比較深入，但在無(wú)脊椎動(dòng)物，特別是海洋軟體動(dòng)物中研究還比較欠缺。最近的研究報(bào)道了蝦夷扇貝配子發(fā)生過(guò)程中性腺整體DNA甲基化水平的變化和PyDNMT在該過(guò)程中的作用。但PyDNMT基因的表達(dá)僅能解釋DNA甲基化的形成和維持，對(duì)PyTET基因的表達(dá)分析有助于理解在蝦夷扇貝配子發(fā)生過(guò)程中DNA去甲基化的過(guò)程。在精子發(fā)生過(guò)程中，PyTET基因在休止期和增殖期的表達(dá)量較高，隨著精子的形成過(guò)程，其表達(dá)量逐步降低，在成熟期達(dá)到最低。由于休止期和增殖期的生殖細(xì)胞類(lèi)型主要為精原細(xì)胞和精母細(xì)胞[20]，原位雜交結(jié)果也表明PyTET基因在這兩種細(xì)胞中均有表達(dá)，表明在蝦夷扇貝精子發(fā)生過(guò)程中，DNA的主動(dòng)去甲基化過(guò)程可能發(fā)生在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中。在卵子發(fā)生過(guò)程中，PyTET基因表達(dá)量在休止期最低，增殖期開(kāi)始升高，并一直維持到成熟期。與原位雜交結(jié)果觀察到的PyTET基因在卵原細(xì)胞有微弱表達(dá)，而在卵母細(xì)胞中有大量表達(dá)的結(jié)果一致。這里可能涉及到兩個(gè)DNA去甲基化的過(guò)程，第一個(gè)過(guò)程是卵原細(xì)胞中的PyTET參與了卵子發(fā)生過(guò)程中的DNA主動(dòng)去甲基化過(guò)程，第二個(gè)過(guò)程是在初級(jí)卵母細(xì)胞中的PyTET，在精卵結(jié)合后，與哺乳動(dòng)物TET3的相似，發(fā)揮著受精卵中DNA主動(dòng)去甲基化的功能[11-12]。

蝦夷扇貝受精卵的DNA來(lái)源于精子和成熟卵，其DNA甲基化模式也同時(shí)被繼承，初級(jí)卵母細(xì)胞中表達(dá)大量PyTET基因可能與受精卵時(shí)期的DNA去甲基化過(guò)程有關(guān)，這一過(guò)程在哺乳動(dòng)物中已有報(bào)道[29-31]。由于PyTET基因在2～8細(xì)胞期的表達(dá)量接近于0，與哺乳動(dòng)物中的情況相同，推測(cè)這一過(guò)程可能在受精卵分裂之前已經(jīng)完成。但不同的是在囊胚期，PyTET基因的表達(dá)突然升高，在隨后的原腸胚時(shí)期又降低，使囊胚期形成了PyTET基因的表達(dá)量高峰，這一現(xiàn)象表明，蝦夷扇貝可能在囊胚期發(fā)生了與哺乳動(dòng)物不同的DNA去甲基化過(guò)程，這或許是海洋軟體動(dòng)物中特有的現(xiàn)象。前期研究顯示，PyDNMT3在囊胚期的表達(dá)量也突然升高，基因組整體DNA甲基化水平在囊胚期也突然升高然后降低[21]。綜合以上結(jié)果，本研究者推測(cè)在蝦夷扇貝囊胚期可能發(fā)生了劇烈的DNA甲基化的重建，既包括DNA從頭甲基化，也包括DNA去甲基化，PyDNMT3和PyTET在其中發(fā)揮著重要作用。