何羿霖， 白 潔,2， 白曉巖， 李巋然??

(1.中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266100； 2.中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100；3.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003)

隨著納米技術的發(fā)展，納米材料越來越多的被應用于抗菌物質、藥物載體、污水處理等領域[1]。早在16世紀，人類就發(fā)現(xiàn)銀及其復合物具有較強的抑菌殺菌作用，銀在抗菌抑菌方面具有更多其他材料不具備的優(yōu)點，諸如具有持久性、光譜性、耐熱性等理化性能[2]。與 Ag+相比，納米銀的抑菌能力更有效和持久，并且可以防止細菌二次污染，被廣泛應用于各領域，在生產、運輸、消費和處置的過程中，納米銀等重金屬會通過大氣沉降、地表徑流等形式匯入海洋[3-4]。目前，在近岸海域已檢測到多種納米材料的存在，其環(huán)境預測濃度已達到“mg/L”級別。已有研究表明，工業(yè)排放水中納米銀濃度范圍可達1～6 mg/kg，青島近海位于納米銀進入環(huán)境，發(fā)生遷移行為的路徑上，同時隨著排放量的增加其環(huán)境濃度呈指數(shù)上升[5-6]。盡管進入環(huán)境中的納米銀背景濃度不高，但是其在環(huán)境中具有持久性和生物積累效應，進入水體中的納米銀可能會對碎屑分解、生物地球化學循環(huán)和基礎食物鏈的物質傳遞產生消極影響[7-9]。而微生物是這些重要生態(tài)過程的主要參與者和完成者，同時也是物質和能量的儲存庫，在生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)中發(fā)揮著不可替代的重要作用。

納米銀體積極小，具有小尺寸效應和表面效應，可吸附在細菌細胞壁表面上，細菌細胞壁成分主要成分肽聚糖中的 -NH-、-COOH 官能團可與納米銀發(fā)生反應，導致細胞壁腐蝕，納米銀鑲嵌入細胞膜中[10]。當納米銀嵌入細胞膜后，會釋放Ag+，使細菌細胞膜的通透性遭到破壞，導致細胞內的蛋白質、無機鹽和還原糖外漏，影響細菌細胞正常的跨膜運輸，破壞了細菌細胞的代謝系統(tǒng)和與外界的通信，使生長速度降低，從而抑制細菌的生長與活性[11]。當納米銀徹底滲透進入菌體內部后，會與細菌的酶蛋白巰基迅速結合，導致酶失去活性，由此造成細菌自身不能進行新陳代謝而最終死亡[12-13]。有研究表明，納米銀能與大腸桿菌的胞內蛋白和酶相互作用[12]，而細菌可通過胞外酶的釋放，將水生生態(tài)系統(tǒng)食物網很難利用的相對較大的顆粒轉化為可供低營養(yǎng)級生物利用的能量(碳)和營養(yǎng)物質[14]，但納米銀對細菌胞外酶的影響的研究卻很少，且絕大部分的研究都是在培養(yǎng)基條件下進行。探討納米銀對自然海水中浮游細菌生長及活性的影響對深入研究納米材料對海洋生態(tài)系統(tǒng)的作用機制具有重要的參考價值，而青島沿岸經濟發(fā)達，受人類活動影響較大，因此探討納米銀對青島近海浮游細菌的影響具有重要意義。

水體中的大顆粒物質無法直接通過細菌細胞膜，浮游細菌利用胞外酶從水體中的大顆粒物質中獲取碳、氮、磷等營養(yǎng)物質，堿性磷酸酶可以作用于有機物或無機物的單磷酸酯鍵，細菌可以通過堿性磷酸酶從胞外獲取磷和碳；氨肽酶可以作用于氨基酸的N端，細菌可以通過氨肽酶從胞外獲取氮和碳，這兩種酶是細菌維持正常生長和活性的重要胞外酶。本研究通過現(xiàn)場采樣、實驗室模擬培養(yǎng)，研究了不同濃度納米銀對青島近海海水中細菌胞外酶活性(堿性磷酸酶活性和氨肽酶活性)、蛋白質含量和細菌死亡率的影響，為深入探討納米銀對近海海水環(huán)境的生態(tài)影響機制及環(huán)境效應提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用納米銀及預處理

本研究所用納米銀粉購自 SIGMA-ALDRICH?，粒徑<100 nm，銀純度>99.5%。取一定量的納米銀，加入一定量經 0.22 μm 濾膜過濾的滅菌去離子水。納米銀溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，為了防止納米銀聚集，使用前在冰浴條件下，將所用納米銀懸浮液用超聲波(230 V，50 kHz)超聲分散 40 min。

1.2 樣品采集與環(huán)境因子測定

本研究所用海水于2018年1月采自青島附近海域S站位(120° 22′ 52.32″ E，36°2′ 27.96″N)(見圖1)。使用酸清洗過的無菌聚乙烯塑料瓶采集表層海水水樣，立即用 2 μm 濾膜過濾(去除原生動物)，低溫保存立即帶回實驗室。采集海水樣品的同時，采用 YSI6600 多參數(shù)水質測定儀測定現(xiàn)場海水pH值、鹽度和電導率等環(huán)境參數(shù)，現(xiàn)場環(huán)境理化參數(shù)為：pH=7.92、鹽度30.7、電導率32 156 μS/cm。

1.3 實驗分組和培養(yǎng)體系的建立

實驗共設置3個不同濃度的納米銀處理組和1個對照組，分別為對照組C(0 mg/L)、低濃度納米銀組L(0.5 mg/L)、中濃度納米銀組M(5 mg/L)以及高濃度納米銀組H(50 mg/L)，各組設置3個平行實驗組。將水樣分裝于12個無菌NalgeneTM聚碳酸酯瓶(Thermo ScientificTM)，每瓶裝入過濾海水 2 L，取一定量納米銀儲備液分別加入各試驗水體中，混勻，用無菌半透膜封口，置于室溫振蕩培養(yǎng)48 h。分別在0、4、8、16、24、36和48 h于各組培養(yǎng)體系取出一定量樣品，用于測定堿性磷酸酶活性、亮氨酸氨肽酶活性、蛋白質含量和死、活細菌數(shù)量。

圖1 采樣站位

1.4 樣品測定

1.4.1 堿性磷酸酶活性(APA)測定 將采集的樣品以磷酸苯二鈉為底物，37 ℃ 培養(yǎng) 15 min，采用紫外可見分光光度計(TU-1810)于 510 nm 下測定酚含量。以單位時間內每 1 mL 樣品水解底物產生的酚含量表示堿性磷酸酶活性[15]。

1.4.2 氨肽酶活性(ALP)測定 將采集的樣品以L-亮氨酸-4-硝基苯胺(現(xiàn)用現(xiàn)配，以無水乙醇充分溶解，置于棕色試劑瓶中，避光保存)為底物，58 ℃ 培養(yǎng) 15 min。反應結束后立即取出，冰浴終止反應，于用紫外可見分光光度計(TU-1810)在 405 nm 下測定吸光度值。以單位時間內每 1 mL 樣品水解底物產生的對硝基苯胺(p-NA)含量表示氨肽酶活性[16]。

1.4.3 蛋白質含量測定 將采集的樣品加入考馬斯亮藍 G-250 試劑，混勻后靜置，用紫外分光光度法于 595 nm 波長下測定吸光度值，計算蛋白質含量[17]。

1.4.4 細菌死亡率測定 采用染料 SYBR green1 與碘化丙啶(PI)雙染色法判定死、活細胞，其中，染料 SYBR green1 能夠穿透活細胞完整的細胞膜與核酸物質結合產生 520 nm (綠色)熒光[18]；染料 PI 只能穿透結構受損的細胞膜與其核酸物質結合，產生 617 nm (紅色)熒光[19]。

細菌細胞死/活狀態(tài)采用流式細胞儀(BD公司，美國)測定，激發(fā)波長 488 nm。采用 FL1 通道收集 SYBR 熒光，F(xiàn)L2 通道收集 PI 熒光，分別表征活細胞和死亡細胞，如圖2所示[20]。

細菌細胞死/活狀態(tài)由細菌死亡率(P)表示，其計算公式[21]為：

(圖中E1為PI染色的死細胞；E2為SYBR green1染色的活細胞。E1 represents death cells； E2 represents survival cells.)

圖2 流式細胞儀細胞死/活狀態(tài)計數(shù)圖

Fig.2 Death/survival cell count of flow cytometry

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用BD Accuri C6 Plus軟件(BD公司，美國)對流式細胞儀數(shù)據(jù)進行分析統(tǒng)計細胞數(shù)。所有數(shù)據(jù)用 Excel 2013 和 SPSS 19.0 分析軟件進行數(shù)據(jù)處理、分析和統(tǒng)計。使用Origin8.5作圖軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 納米銀對浮游細菌死亡率的影響

不同濃度納米銀作用下，海水中細菌死亡率隨時間變化趨勢如圖3所示。在沒有外界營養(yǎng)物質輸入的情況下，細菌對營養(yǎng)物質的競爭，和培養(yǎng)體系中存在的病毒噬菌體的裂解作用，導致空白組的細菌死亡率出現(xiàn)上升趨勢。各實驗組0～4 h的細菌的死亡率有明顯升高，于4 h時高濃度納米銀組細菌死亡率達到高值，為88.20%，是同期空白組的1.72倍，此時納米銀對細菌死亡率的影響最為明顯，各實驗組對浮游細菌死亡率表現(xiàn)出極顯著的抑制效應(P<0.01)；在8～24 h，實驗組細菌死亡率出現(xiàn)逐漸降低又升高的趨勢，并在暴露24 h后，高濃度納米銀組死亡率達到峰值88.69%，是同期空白組的1.33倍；在24～48 h，除高濃度納米銀組，其余實驗組細菌死亡率呈現(xiàn)下降趨勢，但變化過程緩慢。低、中濃度納米銀組的前半期變化趨勢與高濃度納米銀組的變化趨勢類似，但不同于高濃度納米銀組的是，在培養(yǎng)后期，細菌死亡率呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢，可能是由于細菌對納米銀脅迫產生了一定的適應性。

圖3 納米銀對細菌死亡率的影響

納米銀對細菌生長具有明顯的抑制作用。隨著納米銀濃度的升高，對細菌生長的抑制率也隨之升高，具有明顯的濃度梯度效應[22]。在不同濃度納米銀作用下，細菌死亡率在短時間內顯著升高，但隨著時間的推移，呈現(xiàn)緩慢恢復的狀態(tài)。隨著脅迫時間延長，細菌產生了一定的抗性，表明細菌對于納米銀脅迫具有一定的適應性，但到后期在納米銀和營養(yǎng)物質減少的雙重作用下，細菌數(shù)量再一次降低，進而導致死亡率再次上升[23]。

2.2 納米銀對蛋白質含量的影響

不同濃度納米銀作用下，海水中蛋白質含量的變化趨勢如圖4所示。納米銀暴露8 h后，高濃度納米銀組蛋白質含量達到最低值21.453 mg/L，此時抑制效率最高，相比空白組降低了29.80%，在培養(yǎng)前期各實驗組較對照組都有顯著的抑制作用(P<0.05)。在16 h后，各實驗組蛋白質含量開始呈現(xiàn)出上升趨勢，高濃度納米銀組蛋白質含量達到28.021 mg/L，但仍比對照組低 8.32%，而中濃度和低濃度組蛋白質含量均高于對照組，細菌對納米銀脅迫開始出現(xiàn)適應性；在16～24 h蛋白質含量又緩慢降低，可能是由于水體中營養(yǎng)物質的減少，實驗組細菌死亡率升高，導致蛋白質含量降低，細菌體內堿性磷酸酶和氨肽酶受到誘導，活性有所增加。在培養(yǎng)后期各實驗組蛋白質含量都表現(xiàn)出了波動，但在培養(yǎng)結束時，各實驗組蛋白質含量均低于對照組。中濃度納米銀組與低濃度納米銀組的變化趨勢類似。由單因素方差分析結果可以看出，高濃度納米銀添加組較對照組表現(xiàn)出顯著的抑制效應(P<0.05)，低、中濃度組相比的抑制效應物顯著性差異(P>0.05)，因此納米銀對細菌蛋白質含量的抑制作用沒有明顯的濃度梯度效應。

圖4 納米銀對細菌蛋白質的影響

2.3 納米銀對細菌酶活性的影響

2.3.1 納米銀對堿性磷酸酶活性(APA)的影響 不同濃度納米銀作用下，海水中堿性磷酸酶活性的變化趨勢如圖5所示。在納米銀添加后，各實驗組堿性磷酸酶活性都出現(xiàn)不同程度的降低，細菌對納米銀脅迫表現(xiàn)出急性毒性效應，在培養(yǎng)1～4 h抑制效應最強，高濃度組堿性磷酸酶活性達到最低值31.469 mg·L-1·h-1，相比空白組降低了8.58%。在暴露16 h后，高濃度組堿性磷酸酶活性降到最低值31.469 mg·L-1·h-1，此時相比空白組降低了7.78%；在培養(yǎng)后期，堿性磷酸酶活性呈現(xiàn)恢復趨勢，可能是由于細菌對納米銀暴露產生適應性恢復。在實驗室模擬培養(yǎng)周期內，低、中濃度納米銀組和高濃度納米銀組的變化趨勢類似，但堿性磷酸酶活性始終高于同期高濃度組。從單因素方差分析中可以看出，高濃度組堿性磷酸酶活性較對照組有極其顯著的差異性(P<0.01)，且濃度越高，顯著性差異越明顯。由此可見，不同納米銀濃度作用下酶活性受到抑制的程度不同，高濃度組堿性磷酸酶活性抑制最為明顯(P<0.01)，表現(xiàn)出明顯的濃度梯度效應。

圖5 納米銀對堿性磷酸酶活性的影響

2.3.2 納米銀對氨肽酶活性(ALP)的影響 不同濃度納米銀作用下，培養(yǎng)體系中氨肽酶活性的變化趨勢如圖6所示。各實驗組氨肽酶活性較對照組都有降低，在納米銀脅迫下4 h后，高濃度組氨肽酶活性相比于對照組抑制率達到18.62%，抑制效應顯著(P<0.01)；16 h后，高濃度組氨肽酶活性相比空白組降低了32.55%，抑制效率達到最高；在16～24 h內，氨肽酶活性呈現(xiàn)恢復趨勢，細菌對納米銀脅迫表現(xiàn)出適應性恢復。中濃度組和低濃度組變化趨勢與高濃度組基本相同，但是氨肽酶活性也是始終高于高濃度組，基本趨勢為納米銀濃度越高，酶活性越低。在實驗周期內，細菌氨肽酶活性在短時間內受到抑制，但在培養(yǎng)后期逐漸恢復，由此可見，納米銀對細菌氨肽酶活性的影響是短暫的[24]。由單因素方差分析可以看出，在0～24 h，高濃度組相比于對照組具有極顯著性差異(P<0.01)，中濃度組對比于對照組也具有顯著性差異(P<0.05)，低濃度組無顯著性差異(P>0.05)； 在24～36 h， 各濃度組相比于對照組無顯著性差異(P>0.05)。由此可知，細菌氨肽酶活性受納米銀抑制的大小具有濃度梯度效應且在培養(yǎng)后期氨肽酶活性受納米銀脅迫影響較小。

圖6 納米銀對氨肽酶活性的影響

綜合納米銀對兩種細菌重要胞外酶活性的影響可以看出，納米銀暴露環(huán)境下，細菌胞外酶活性均具有明顯抑制效應，且納米銀濃度越高，抑制效應越顯著。在納米銀加入前期，細菌就會產生強烈的應激反應，在納米銀暴露4 h后，各實驗組納米銀相比于對照組對細菌酶活性的抑制最強，表現(xiàn)出急性毒性效應，在納米銀暴露16 h后，酶活性達到最低值，16 h后，各實驗組酶活性緩慢升高，細菌對納米銀暴露產生了一定的適應性。

3 討論

本研究中，在納米銀脅迫4 h后所有實驗組浮游細菌死亡率較同期對照達到了峰值，實驗組細菌死亡率較對照組有明顯區(qū)別，納米銀濃度越高，細菌死亡率越高。然而，納米銀對細菌的抑制效應在培養(yǎng)16 h后開始減小，實驗組細菌死亡率與同期對照差異減小，浮游細菌開始出現(xiàn)適應性。這說明了本研究中使用的納米銀對細菌具有毒性效應，但納米銀對細菌的抑制在培養(yǎng)后期出現(xiàn)了適應性，高濃度納米銀對細菌的抑制效應相對較強，細菌的適應性較弱。隨著納米銀暴露濃度的增加，納米銀顆粒的數(shù)量增加，因此隨著更多納米銀顆粒與細菌的動態(tài)混合，導致海水中的納米銀對細菌生長產生更加明顯的抑制作用，呈現(xiàn)出一定的劑量效應關系。由此可見，高濃度納米銀對細菌有極顯著的抑制效應，其可能原因有三種，即抑制細菌增殖、誘導細菌凋亡或誘導細菌死亡。納米材料對海洋生態(tài)系統(tǒng)的短期影響可能出現(xiàn)在局部水體或納米材料點源輸入附近的地點，但隨著時間的推移，在遠離近岸和納米銀輸入點源的海區(qū)這種影響可以通過在海水中的稀釋來克服[25]。

納米銀進入水體后釋放的Ag+可以通過攻擊細胞膜上或者細胞內部的含硫蛋白質破壞細胞的結構和功能，Ag+與含硫、磷的基團結合或與蛋白質三維結構中的二硫鍵結合，使蛋白質結構破壞而失去活性，從而抑制細菌細胞的新陳代謝[26]。實驗組蛋白質含量在培養(yǎng)前期較對照組有明顯抑制(P<0.05)，但在納米銀添加16 h后，蛋白質含量出現(xiàn)波動，細菌對納米銀脅迫出現(xiàn)適應性。細菌的 DNA 堿基對也可以與納米銀釋放的Ag+發(fā)生化學反應，與細菌 DNA 中的嘌呤和嘧啶相鄰的氫鍵發(fā)生置換反應，形成復雜的交叉鏈接，導致 DNA 無法自我復制和轉錄，致使蛋白質空間結構破壞失去活性進而導致細菌細胞死亡[27-29]。但納米銀對細菌的抑制是短暫的，培養(yǎng)后期，實驗組的蛋白質含量與空白組相近。在整個過程中，蛋白質含量隨著脅迫時間延長出現(xiàn)恢復的跡象，這種恢復可能與部分不敏感的細菌群落有關。當細菌受到納米銀脅迫時，會產生更多的蛋白質(如：酶、無序蛋白或其他應激蛋白等)通過解毒代謝來減輕傷害，由此導致細菌活性升高而出現(xiàn)對納米銀脅迫具有一定的適應性。而高濃度的納米銀造成蛋白質含量的減少可能是因為蛋白質合成過程受到干擾，減少了蛋白質的合成，或者因為蛋白質的分解加速[30]。

在本研究中，納米銀添加對細菌堿性磷酸酶和氨肽酶都有明顯的抑制。在大腸桿菌培養(yǎng)實驗中，納米銀添加使細菌胞內色氨酸酶的活性降低60%以上，納米銀屏蔽了酶的部分活性基團或改變了酶的結構而導致酶活性降低甚至失去活性[31]。納米銀顆粒接觸并進入細菌后，會與酶的氧、氮和巰基等重要功能基團結合，引起酶的三維構象改變，或替換出酶中的金屬離子，進而影響酶的穩(wěn)定性，最終影響酶發(fā)揮催化功能[32]。當水體中的營養(yǎng)物質濃度較低，不足以維持細菌生長時，細菌體內堿性磷酸酶和氨肽酶將受到誘導，使其活性顯著地增加[32]。但由于納米銀的持續(xù)影響，酶活性增長率低于抑制率，使其在1～8 h內活性并沒有明顯升高，但在16 h后，與對照組酶活性相差幅度減小，在暴露36 h后，酶活性顯示恢復的跡象。在培養(yǎng)的中后期，各濃度納米銀作用條件下，酶活性都表現(xiàn)出了恢復的趨勢，表明細菌胞外酶的活性對納米銀的脅迫具有一定的適應性。

4 結論

(1)納米銀對青島近海水體中的細菌生長和活性具有一定的抑制作用。納米銀作用下細菌酶活性和蛋白質含量都顯著下降，納米銀脅迫會影響細菌正常生理代謝，導致細菌死亡率升高和環(huán)境功能的下降。

(2)在納米銀暴露初期，細菌死亡率顯著升高，細菌酶活性和蛋白質含量受抑制程度最高，但在暴露后期呈現(xiàn)緩慢恢復的趨勢，表現(xiàn)出對納米銀脅迫具有一定的適應性。

(3)隨著納米銀濃度的升高，細菌死亡率和酶活性的抑制率均隨之升高，蛋白質含量降低，表明納米銀對細菌生長和酶活性的抑制具有顯著的濃度梯度效應。