李陽春， 王昭萍??， 劉 劍， 馬培振

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003；2. 煙臺海益苗業(yè)有限公司，山東 煙臺 264000)

三倍體貝類具有生長快、風味好、育性差、夏季死亡率低等優(yōu)勢[1-3]，自Stanley[4]利用細胞松弛素B(Cytochalasin B, CB)成功誘導美洲牡蠣(Crassostreavirginica)三倍體以來，三倍體育種已相繼在三十余種貝類中開展了研究。目前采用的誘導方法主要有物理法(靜水壓[5]、冷/熱休克[6])、化學法(CB，6-二甲基氨基嘌呤[7]，咖啡因[8])和生物法(二倍體和四倍體親本配合[9])。近年來，王昭萍等[10]研究顯示，低鹽作為一種新的三倍體誘導方式，具有誘導效果好，成本低、操作便捷、安全無毒等優(yōu)點，具有廣闊的推廣前景。

之前對于低鹽誘導三倍體的研究中，于瑞海[11]、孔靜[12]、陳宏發(fā)[13]等相繼給出了不同鹽度誘導條件下太平洋牡蠣(Crassostreagigas)受精卵的卵裂率、孵化率和三倍體率，同時應用“孵化率×三倍體率”的值作為綜合評價指標，判斷三倍體的誘導效果，從而得出最佳的誘導條件。然而，為了給生產(chǎn)實踐提供更好的理論依據(jù)，有必要對卵裂率和孵化率隨誘導鹽度的變化趨勢進行進一步分析，同時探索一種更為科學合理的綜合評價方法。

利用已有數(shù)據(jù)建立模型估測不同卵裂率、孵化率對應的誘導鹽度，其原理與半數(shù)效量的估測類似。半數(shù)效量廣泛應用于評測外界脅迫的致死率[14]、致畸率[15]、致突變率[16](半數(shù)致死劑量，LD50)，及評斷藥物的有效劑量[17](半數(shù)有效劑量，ED50)，在貝類中也被用來探究細菌感染、金屬沉積物等的危害[18-20]。統(tǒng)計學中可以通過概率單位加權回歸，得到脅迫程度(藥物劑量、細菌感染量等)和脅迫效果(有效率、死亡率等)之間的回歸曲線，從而反映不同脅迫條件下的致死效應[21]，該回歸可利用Probit回歸分析實現(xiàn)[15]。

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是研究如何通過少數(shù)幾個主成分來解釋多個變量的分析方法。其通過正交變換將原變量進行線性組合得到一組新變量(主成分)，使它們盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此不相關，并選取少數(shù)幾個在變差總信息量中比例較大的主成分來進行分析，從而達到減少變量的目的[22-23]。該方法十分適用于綜合分析多個因素，以探討三倍體的誘導效果。

本研究利用概率單位加權回歸法，分別得到了鹽度與卵裂率及鹽度與孵化率的回歸擬合，為估測特定卵裂率和孵化率對應的誘導鹽度提供了模型，并應用配對樣本T檢驗對該模型的可信性進行了驗證；同時利用主成分分析法，對不同誘導鹽度下的卵裂率、孵化率和三倍體率進行了降維，抽取了兩個分別代表卵裂、孵化率和三倍體率的主成分，分別計算了主成分的得分和不同誘導鹽度的綜合得分，為探究三倍體最佳誘導條件提供了一種更加全面科學的評價方法。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用2齡種貝(殼長8～14 cm)取自煙臺海益苗業(yè)有限公司，經(jīng)升溫促熟培育后待用。

1.2 方法

1.2.1 精卵獲取及受精 實驗所用海水均為過濾自然海水，鹽度為30，水溫為23～25 ℃，器械每次操作前均使用淡水殺死精子，避免精子污染。挑選性腺發(fā)育程度較好的親貝，洗刷干凈后開殼，解剖針挑取適量性腺鏡檢，區(qū)分雌雄。雌性親貝取卵，卵液先用300目篩絹過濾去除組織碎屑，后用1 000目篩絹以過濾海水沖洗2～3遍去除混入的組織液消化液等，不同親貝的卵液置于不同的100 mL燒杯內(nèi)，浸泡50 min促熟，鏡檢，選取卵子形狀近圓、卵內(nèi)物質致密的卵液混合，濃縮卵液至700～800 mL，調(diào)整卵子密度為7 000～8 000個/mL[24]。受精前10 min解剖取精子，挑選精子活力高的精液，用300目篩絹過濾去除組織碎屑，以卵子∶精子=1∶5～1∶6的比例進行受精[13]。

1.2.2 低鹽誘導處理及幼蟲培養(yǎng) 40%～50%受精卵出現(xiàn)第一極體(PB1)時將受精卵液加入500 mL燒杯中，使得終鹽度分別為4，6，8，10，12，14，16和30，低鹽誘導15 min。后迅速轉入20 L桶中進行培養(yǎng)。統(tǒng)計卵裂率、孵化率，24 h后收集D型幼蟲，利用流式細胞術測定三倍體率，染色劑為DAPI，流式細胞儀型號為FC500 MPL(Beckman Coulter, USA)。實驗重復3次。

1.2.3 指標測定

卵裂率 = 卵裂卵數(shù)/受精卵總數(shù)×100%。

孵化率 = D形幼蟲數(shù)/受精卵總數(shù)×100%。

三倍體率 = 三倍體D形幼蟲數(shù)/(三倍體D形幼蟲數(shù)+二倍體D形幼蟲數(shù))×100%。

數(shù)據(jù)表示方法：平均值±標準誤(Mean±SE)。

1.3 概率單位加權回歸及模型驗證

1.3.1 概率單位加權回歸 采用SPSS 19.0中的Probit回歸對數(shù)據(jù)進行概率單位加權回歸，模型選擇概率模型，對回歸得到的結果進行標準化殘差分析，去除不適合進行回歸直線擬合的數(shù)據(jù)，對剩下的數(shù)據(jù)進行第二次Probit回歸，得到最終模型。

1.3.2 模型驗證 根據(jù)Probit回歸得到的模型選擇若干合適的鹽度，按照1.2中的方法測定這些鹽度處理條件下的卵裂率及孵化率，采用SPSS 19.0中配對樣本T檢驗的方法與模型擬合的卵裂率和孵化率進行比較。

1.4 主成分分析

采用SPSS 19.0對卵裂率、孵化率和三倍體率進行主成分分析，參照王芳[22]、李艷雙[23]等的方法，以累計方差貢獻率≥85%作為主成分的選取標準，根據(jù)以下公式計算綜合得分：

綜合評價指數(shù)=主成分1得分×主成分2的方差貢獻率+主成分2得分×主成分1的方差貢獻率。

2 結果與討論

2.1 不同鹽度誘導條件下的卵裂率、孵化率和三倍體率

由圖1可知，隨著誘導鹽度的增加，受精卵的卵裂率、孵化率也隨之增加，而三倍體率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且鹽度8時三倍體率最高，這與于瑞海、孔靜[11-12]等的結果一致。

圖1 不同鹽度誘導條件下的卵裂率、孵化率及三倍體率

2.2 卵裂率與鹽度及孵化率與鹽度的概率單位加權回歸

Pearson擬合度檢驗可用來判斷曲線的擬合效果，其卡方值越小，R2值越接近1，擬合效果越好，由表1可知，該擬合的R2接近0，遠小于1，說明有顯著偏離曲線的點對數(shù)據(jù)的回歸擬合造成了干擾，因此對所有數(shù)據(jù)進行標準化殘差分析，結果見圖2。其中，調(diào)整的R2值越接近1，P值越小，說明殘差回歸效果越好，數(shù)據(jù)的殘差越接近正態(tài)分布，擬合效果越好。

表1 卵裂率及孵化率的Pearson擬合度檢驗

注：CR即卵裂率(cleavage rate)，HR即孵化率(hatching rate)。下同。

Note: CR refers to the cleavage rate, HR refers to the hatching rate. The same below.

圖2 卵裂率數(shù)據(jù)的標準化殘差回歸分析

圖2中顯示，鹽度4的試驗點，其標準化殘差小于-2，落在正態(tài)分布區(qū)間外，因此應將其判定為異常試驗點，不參與回歸擬合。同時，表2中顯示，將鹽度4及30的數(shù)據(jù)依次刪除之后，標準化殘差回歸的R2值增加至接近1，P值降低，表現(xiàn)為極顯著，說明除鹽度4外，鹽度30亦為異常試驗點，將這兩組數(shù)據(jù)刪除后，數(shù)據(jù)的殘差符合正態(tài)分布，擬合出的曲線可信性較高。

將卵裂率和孵化率中鹽度4、30組數(shù)據(jù)均刪除之后，對剩余數(shù)據(jù)進行第二次Probit回歸分析，協(xié)變量(鹽度)選擇不進行轉換、進行以10為底的對數(shù)轉換或自然對數(shù)轉換，進行比較，結果如表1所示。由表1可知，對于卵裂率來說，對鹽度進行以10為底的對數(shù)轉換和進行自然對數(shù)轉換得到的結果相同(卡方=1.135，R2=0.951)，且均優(yōu)于不對鹽度進行轉換得到的結果(卡方=1.586，R2=0.903)，因此隨機采用對鹽度進行以10為底的對數(shù)轉換；對于孵化率來說，不對鹽度進行轉換得到的結果優(yōu)于對鹽度進行以10為底的對數(shù)轉換或自然對數(shù)轉換的結果，因此本次回歸未對鹽度進行對數(shù)轉換。概率回歸結果見表3、4和5。其中卵裂率為50%的誘導鹽度估計值為5.648，孵化率為50%的誘導鹽度估計值為8.644。

表2 卵裂率和孵化率的標準化殘差回歸

表3 卵裂率及孵化率與誘導鹽度的PROBIT模型構建

注：PROBIT 模型: PROBIT(p-CR) = -1.578 + 2.099×鹽度以10為底轉換后的對數(shù)值; PROBIT(p-HR) = -0.851 + 0.098×鹽度。

Note: Probit model: PROBIT(p-CR) = -1.578 + 2.099×Log10(Salinity);PROBIT (p-HR) = -0.851 + 0.098 × Salinity.

表4 卵裂率與誘導鹽度的PROBIT回歸

注：表中黑體數(shù)據(jù)為了突出顯示該組數(shù)據(jù)，以方便讀者查閱，無特殊含義。下表同。

Note: Some data in the table are highlighted in boldface for convenience of reference only and shall not affect the construction or interpretation thereof. The same below.

表5 孵化率與誘導鹽度的PROBIT回歸

2.3 概率單位加權回歸模型的驗證

由于Probit回歸分析采用的鹽度范圍是6～18，因此驗證鹽度的選擇范圍也應為6～18，因此，根據(jù)表4和5的結果，卵裂率選擇的驗證鹽度及其對應估計百分比分別為：7.5/60%，10.0/70%，14.2/80%；孵化率選擇的驗證鹽度及其對應估計百分比分別為：6.1/40%，8.6/50%，11.2/60%，14.0/70%，17.2/80%。驗證結果如表6所示。

表6 不同誘導鹽度下觀測值與回歸模型估計值的比較

由表6可得，所有組別的P值均大于0.05，說明估計值和觀測值之間不存在顯著差異，即該模型對不同誘導鹽度下卵裂率和孵化率的估計較為可信。因此，生產(chǎn)實踐中可參考表4和5的結果，根據(jù)鹽度與卵裂率、孵化率的關系選擇更為合適的誘導鹽度。

2.4 綜合評價指標計算

前人的研究往往采用將孵化率與三倍體率的乘積作為綜合指標來評價誘導效果，然而生產(chǎn)實踐中需考慮的評價因素不僅只有孵化率與三倍體率，卵裂率、附著變態(tài)率、生長速度、抗逆性等因素都應當列入最優(yōu)誘導條件評價體系中，主成分分析作為一種能同時考慮多種影響因素的評價方法，對于誘導條件的選擇是很有意義的。

2.4.1 卵裂率、孵化率與鹽度的主成分分析 由于本實驗數(shù)據(jù)不存在量綱及數(shù)量級的區(qū)別，因此卵裂率、孵化率和三倍體率的數(shù)據(jù)無需進行標準化，可直接進行主成分分析。

主成分分析共抽取了三個主成分，其方差貢獻率分別是73.62%，26.16%和0.22%，為了能夠盡可能多地保留原始變量的信息，主成分的選取通常遵循“累計方差貢獻率≥85%”的標準。按照該標準，我們選取了前兩個主成分用于綜合指數(shù)的計算，其累計方差貢獻率為99.78% (見表7)。對于主成分1，它在卵裂率與孵化率上的特征向量分別為0.936/0.986，而在三倍體率上的特征向量為負值(-0.600)，說明主成分1主要反映了卵裂率和孵化率這兩個原始變量；而主成分2在三倍體率上的特征向量(0.800)則顯著高于在卵裂、孵化率上的特征向量(0.348、0.157)，說明主成分2主要反映的是三倍體率這個原始變量，也就是說主成分1和主成分2很好的反映了所有的原始變量，成功地達到了減少變量的目的。

表7 提取主成分的負荷及其方差貢獻率

2.4.2 綜合評價指數(shù) 根據(jù)這兩個主成分的特征值、特征向量及方差貢獻率得出的綜合評價指數(shù)見表8。結果顯示，隨著鹽度的增加，誘導的綜合評價指數(shù)先升后降，在鹽度為8時達到最大值(0.67)，這與之前的研究結果一致，說明鹽度8的確為適宜的誘導鹽度。然而通過該表格還可以看出，鹽度10的綜合評價指數(shù)也較高(0.54)，與鹽度8相比，表現(xiàn)出更高的卵裂、孵化率(PC1: 0.04>-0.53)和較低的誘導效果(PC2: 0.72<1.09)。因此，生產(chǎn)實踐中可以根據(jù)實際需要選擇誘導鹽度為8(更高的誘導率)或10(更高的存活率)。當然，僅根據(jù)卵裂率、孵化率和三倍體率得出的綜合評價指數(shù)是不全面的，需要進一步實驗提供不同誘導鹽度條件下幼蟲的存活、附著及后續(xù)的生長數(shù)據(jù)，以期得到更為完善的評價體系，為生產(chǎn)實踐提供科學的指導。

表8 不同誘導鹽度條件下的綜合評價指數(shù)

3 結語

本研究通過對卵裂率、孵化率與鹽度進行概率加權回歸擬合和主成分分析，為低鹽誘導太平洋牡蠣三倍體提供了可參考模型與更科學的綜合評價方法。Probit模型提供了不同誘導鹽度下卵裂率與孵化率的估計值，要達到50%卵裂率和50%孵化率的誘導鹽度應分別大于5.648和8.644。主成分分析得出了各誘導鹽度的綜合評價指數(shù)，其中鹽度8，10評價指數(shù)最高，鹽度8誘導率最高但存活率相對較低，鹽度10誘導率稍低但存活率較高，在生產(chǎn)實踐中根據(jù)具體需要，選擇更好的誘導效果或更高的存活率。