沈志遠,張 林

(1.蘭州大學生命科學學院,中國甘肅 蘭州 730000;2.西安交通大學基礎醫(yī)學院,中國陜西 西安 710061)

心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是危害人類健康的主要疾病之一,而動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是CVD的主要病因。AS是一種炎癥性疾病,由低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)在動脈壁的沉積和隨后的修飾引起[1]。白細胞(主要是單核細胞和淋巴細胞)被內皮組織所表達的黏附因子招募聚集,滲透浸潤到動脈內膜并產生大量的炎癥細胞因子和趨化因子[2～3]。之后,浸潤的單核細胞分化成巨噬細胞,攝取修飾后的LDL并逐漸變成體積較大的泡沫細胞,進而促進AS的發(fā)展[4]?，F有研究顯示,多種不同類型的炎癥反應參與AS的發(fā)生和發(fā)展[5],因此,各種炎癥生物標志物被廣泛的研究,用以提高CVD的風險預測[6]。

在迄今報道的炎癥生物標志物中,C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)是最重要的炎癥指標之一。CRP是一種由相同亞基組成的五聚體分子,主要以五聚體CRP(pentameric CRP,pCRP)的形式存在于血液循環(huán)中,在急性炎癥或感染發(fā)作時由肝臟分泌產生[7]。在臨床上,CRP被用作炎癥、感染和組織損傷的非特異性標識物[8]。在機體發(fā)生炎癥或者組織損傷時,CRP血清濃度6 h內可增加1萬倍,而且其分解代謝率與它的血漿濃度并無關聯[9]。CRP不僅是炎癥的重要指標,還是炎癥的調控因子。其被認為是先天免疫的模式識別受體,可以識別并結合多種內源與外源配體,如破損的細胞膜、細菌胞壁和核酸等,結合配體的CRP可以通過其效應面進一步與補體分子C1q和C4bp等結合,激活補體途徑,促進有害物質的清除[10]。此外,CRP還可以通過其效應面結合不同的細胞表面受體,如 FcγR(Fcγ receptor)[11]、FcαR(Fcα receptor)[12]和 LOX-1(lectin-like oxidized LDL receptor-1)[13]等,從而激活多種免疫細胞的應答。以上這些特征都表明,CRP是宿主防御、免疫調節(jié)和炎癥的重要組成部分。當pCRP經循環(huán)系統(tǒng)進入炎癥微環(huán)境或暴露在病理條件下時,可從五聚體解離為單體CRP(monomeric CRP,mCRP)。與pCRP相比,mCRP可以與不同的受體結合,表現出不同的功能特性[14]。mCRP也是一個很強的炎癥調節(jié)因子,可以通過激活補體[15～16]、活化內皮細胞[17]和內皮祖細胞等多種途徑來發(fā)揮其作用。越來越多的證據表明,CRP的功能取決于其構象和定位的不同[14,18～23],而mCRP則是其參與局部炎癥調節(jié)的主要構象。在此基礎上,我們旨在探究CRP構象的變化對AS的影響。

1 CRP與動脈粥樣硬化

炎癥被認為在AS的各個階段都起著關鍵作用,大量炎癥生物標志物的升高已被證明可以預測CVD的發(fā)生。而這些因子中,與CVD最密切相關的生物標志物之一就是CRP。血清中的低濃度CRP(小于5 mg/L),以前被認為沒有臨床意義。但是在20世紀90年代,隨著新的、更敏感的CRP檢測技術的發(fā)展,這些低濃度的CRP被賦予了新的意義,并被稱為高敏感性CRP(high-sensitivity CRP,hs-CRP),之后這種測試方法迅速產生了臨床影響。1997年,Ridker等[24]首次描述了hs-CRP的升高與動脈疾病風險增加的相關性。之后越來越多的證據表明,基于hs-CRP測量的CRP可以獨立于傳統(tǒng)危險因素,用于CVD的風險預測,并且與傳統(tǒng)的風險因素(如高脂血癥和高血壓等[25])一樣密切[26～27]?；谝陨献C據,hs-CRP已經成為在CVD風險預測中領先的生物標志物,并被歸類為Ⅲ類B級證據[28]。在雷諾茲風險評分中,除了傳統(tǒng)的風險因素外,人們還加入了hs-CRP的風險評估,以提高總體風險預測的準確性[29]。研究人員甚至可以基于 hs-CRP 濃度(小于 1.0 mg/L、1.0～3.0 mg/L、大于3.0 mg/L),對低、中、高CVD風險進行分類[26]。而且,根據hs-CRP的水平可以獨立預測正常人群CVD死亡的風險[27]。

此外,CRP在人AS的早期病變組織中可以被檢測到[30],而且其在炎癥部位的水平與疾病的發(fā)展密切相關[31]。有證據表明,AS斑塊大小的變化和治療后復發(fā)事件的風險也與患者CRP水平的變化緊密關聯[32]。除此之外,CRP 還與修飾的 LDL[33～35]、激活的補體[36]和泡沫細胞[30]等致AS介質共定位。這些都意味著CRP不僅僅是一個風險預測因子,還是CVD的直接參與者。事實上,大量的在體和離體實驗證明,CRP可以通過調控CVD相關的炎癥過程影響病情的發(fā)展[37～40]。

盡管有上述令人信服的證據,但也有大量的證據表明CRP與CVD并無因果關系。一些流行病學研究發(fā)現CRP與疾病之間并無相關性[41～44]。例如,CRP基因的非編碼核苷酸多態(tài)性影響CRP的基礎血漿水平,但與未來發(fā)生CVD事件的風險并無關聯[44]。除此之外,許多動物模型實驗也都表明CRP與AS毫無關聯[45～52]。這些爭議使我們無法明確CRP在AS中的確切作用。除了這些離體和在體實驗出現的大量矛盾外,CRP的急性期血漿濃度過高也是一個問題,濃度變化如此巨大的CRP是如何精確調節(jié)炎癥反應的？hs-CRP又是如何能成為CVD的風險預測因子的？這些關于CRP在AS/CVD中的功能作用的種種疑問,都亟待去解決。

2 CRP的活性依賴其構象轉變

上述這些矛盾以及謎題,或許可以通過CRP在局部炎癥發(fā)生的構象以及活性的變化來解答。pCRP的五聚體結構在一定的條件下[53～56]被破壞,從而形成單體的亞基,即為mCRP。pCRP解離為mCRP的過程伴隨著二級結構元件的丟失和三級結構的顯著改變,這導致了mCRP獨有表位的表達,也賦予了mCRP新的生物活性與功能[16,54,57～60]。

事實上,CRP變構為mCRP會顯著增強其與各種配體之間的相互作用以及其激活補體的能力。實驗表明,mCRP與天然的和經過修飾的LDL有強烈的結合,而pCRP與LDL只有低至中度的結合[60]。此外,mCRP在游離狀態(tài)和結合狀態(tài)下均可與C1q有相互作用,而pCRP僅在與多價配體結合后才能結合C1q[16]。mCRP通過結合C1q激活或者抑制經典補體途徑,這取決于mCRP是處于游離狀態(tài)還是表面結合狀態(tài)[16]。后續(xù)研究進一步揭示,mCRP通過結合細胞表面的C1q、因子H和C4b等補體成分,發(fā)揮其促進細胞凋亡以及壞死細胞的非炎癥清除作用[15,61]。另外,mCRP還可以在短時間內(4 h)通過頂端刺激人冠狀動脈內皮細胞,上調單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、IL-6、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和E-選擇素(CD62E)等因子的表達,進而激活內皮細胞[17],而pCRP則需要較長時間(24 h)[17,62]。這些研究說明,之前發(fā)現的CRP的相關功能很可能是pCRP發(fā)生構象變化解聚為mCRP所致。

3 炎癥局部發(fā)生CRP變構并增強其生物學活性

mCRP的生物活性明顯增強,說明mCRP可能是一種被激活的CRP變體,而pCRP則只是mCRP的前體,是一種基礎狀態(tài)的結構。然而,自從mCRP的概念提出以來,關于mCRP的生物學活性已經爭論了幾十年。主要的問題是,pCRP的分子結構非常穩(wěn)定,而mCRP的制備則需要對pCRP進行高度變性處理。因此,識別具有病理生理相關性的pCRP解離途徑是解決這一問題的關鍵。通過電鏡成像、免疫熒光等途徑,Ji等[54]發(fā)現pCRP與受損的生物膜(包括脂質體和細胞膜)結合可導致其部分構象快速的變化,進而解聚為mCRP,期間還伴隨著補體系統(tǒng)的活化。另外,有研究發(fā)現pCRP在壞死細胞和活化的血小板膜表面也可以以溶血蛋白依賴的方式結合和解離[56]。受損細胞膜誘導的pCRP解聚進一步揭示了mCRP的顯著積累和有效作用最有可能發(fā)生在炎癥位點,即損傷壞死細胞和受損細胞膜富集的地方。使用高特異性抗體的免疫組化分析顯示,在AS斑塊[56,63]、糖尿病[64]以及腦卒中[65]等疾病中,局部病變部位存在的CRP主要亞型都是mCRP,而不是pCRP。病灶處pCRP的解聚不僅用于增強其生物學活性的表達,還是一個緩沖機制,避免了急性炎癥期pCRP濃度急劇升高而導致的全身性效應,這也為我們解釋了CRP極有可能是通過構象的改變從而實現其對炎癥反應的精細調控。

迄今發(fā)現的所有pCRP解聚生成mCRP的途徑都與局部炎癥條件有關,如細胞膜受損[54,56,61]、病理蛋白質聚集[66]和活化細胞釋放的微粒[55]等。另外,活化的巨噬細胞/單核細胞的直接合成也是mCRP的一個來源[67],但是這條途徑也與炎癥相關。因此,pCRP可能只是作為全身炎癥的標志物,而mCRP則是局部炎癥的活躍分子。盡管如此,如果局部形成的mCRP能夠釋放到循環(huán)中,它極有可能成為比pCRP更好的潛在炎癥標志物。研究發(fā)現,循環(huán)系統(tǒng)中的細胞微泡上就攜帶有mCRP[55]。另有研究報道,mCRP自身抗體與自身免疫病[68～70]等全身性炎癥疾病密切相關。因此,相較于pCRP,mCRP可能是一種更好的炎癥標志物。最近,Zhang等[71]優(yōu)化了血漿中檢測mCRP的ELISA方法,該檢測方法可重復,而且靈敏度非常高(達到1 ng/mL)。這為研究mCRP與AS以及其他炎癥疾病之間的關系提供了一個非常簡捷有效的工具。

4 mCRP活性調節(jié)的機制研究

mCRP在炎癥各方面的作用正在逐步被人們發(fā)現,但是mCRP的具體作用機制仍不太清楚。研究發(fā)現,從不同的制備方法中獲得的mCRP會表現出明顯不同的生物學活性。通過尿素變性pCRP和基因重組兩種方法制備的mCRP,雖然它們都表達相同的表位,但后者卻具有更強的促炎活性,例如:與LDL的結合力更強[60];具有較強的結合補體C1q并進一步激活補體的能力[16];可激活HAECs細胞,促進單核細胞與HAECs細胞的黏附[62]。然而,隨著亞基間二硫鍵的還原,來自pCRP脲變性的mCRP會表現出與重組mCRP類似的活性,說明亞基間二硫鍵是mCRP功能的一個重要開關[58]。每個CRP亞基都包含兩個進化保守的半胱氨酸殘基(Cys36和Cys97),它們形成二硫鍵以穩(wěn)定亞基的疏水核心。當pCRP解離為單體亞基時,二硫鍵才會被還原,說明pCRP的解離是亞基間二硫鍵還原的先決條件[72]。硫氧還蛋白是一種普遍存在的對二硫鍵氧化還原穩(wěn)態(tài)至關重要的還原酶,研究發(fā)現它可以高效還原mCRP,而且mCRP還與硫氧還蛋白在AS斑塊中共存[58],說明mCRP的還原可能發(fā)生在局部炎癥中。在半胱氨酸突變的mCRP中,人們也得到了相似的結果[58]。這些結果表明,亞基間二硫鍵是調節(jié)mCRP活性的重要開關。

FcγRⅢ(CD16)是mCRP的受體。mCRP通過與CD16的相互作用,可以延緩中性粒細胞凋亡,并誘導其活化、黏附和遷移;也可以激活HAECs細胞,刺激單核細胞產生活性氧。然而,研究發(fā)現添加CD16的阻斷劑僅能少部分抑制mCRP的活性[62,73],這說明細胞上還存在有其他更重要的mCRP受體。脂筏是細胞膜上特有的信號傳遞平臺,細胞信號網絡的許多重要組成部分,如G蛋白偶聯受體、表皮生長因子受體和T細胞受體等,要么是組成性地駐留在脂筏中,要么是在特定的刺激下迅速被募集到脂筏中。研究報道,mCRP可以直接插入內皮細胞細胞膜富含膽固醇的脂筏微區(qū)[57]并與之結合,繼而激活內皮細胞;通過MβCD(methylβ-cyclodextrin)和制霉菌素破壞脂筏的結構,能有效地抑制mCRP對內皮細胞的活化[57]。因此,脂筏可能是mCRP在細胞膜上的主要受體,與脂筏的相互作用,可以給予mCRP特有的優(yōu)勢去激活各種信號元件。上述結論在一些實驗研究中得到證實。例如:mCRP可以通過脂筏介導其與單核細胞以及血小板的結合[56];脂筏的破壞可以逆轉mCRP在內皮細胞纖維蛋白凝塊形成中的促進作用[74]。

進一步的深入研究發(fā)現,mCRP上存在一段在進化中非常保守的序列——膽固醇結合基序35～47(cholesterol binding sequence,CBS;aa 35～47),而且該序列是負責介導mCRP與多種配體結合的關鍵序列[57,75]。例如:mCRP與脂蛋白ApoB、補體成分C1q以及膜脂成分膽固醇等多種配體的結合,都可以被合成的CBS多肽抑制,而其他CRP的多肽序列則沒有此功能[75]。除此之外,mCRP的C-端八肽(aa 199～206)被認為是mCRP插入脂筏的主要決定因素[57]。結構分析顯示,在pCRP中,CBS位于亞基的疏水核心,而C-端八肽位于亞基之間相互作用的界面。隨著pCRP在細胞膜上的解離,CBS序列暴露出來。然后,mCRP通過CBS與膽固醇結合,并通過其C-端八肽插入脂筏,激活對應的下游信號分子,進而發(fā)揮其相應的生物學功能[57]。

5 總結

CRP在AS中的作用其實是非常復雜的。在炎癥微環(huán)境中,pCRP通過各種途徑解聚為mCRP[54～56,66]。在AS的早期,CRP 水平只有少量升高,mCRP的含量也相對較少,這時,mCRP通過調節(jié)補體途徑[15～16,61]和LDL的代謝[13,22,35,60],促進損傷物質的清除,起到保護以及緩解AS的作用;隨著AS的進展,血液中的pCRP濃度急劇升高,病灶處大量的壞死細胞也為CRP提供了足量的變構配體,同時CRP亞基間的二硫鍵進一步還原,使其暴露出更多的CBS位點,導致單核細胞、血小板以及補體等的過度活化,從而發(fā)揮其促炎作用,最終促進AS的發(fā)展以及血栓的形成(圖1)。這種多層次的級聯機制使CRP可以通過其構象變化,完成其對炎癥的精細調控。但是,對于mCRP在AS整個進程中的作用及具體分子機制,目前還沒有一個完整的、清晰的以及系統(tǒng)的認識。需要指出的是,CRP不同構型的研究可為我們提供一種新的思路,也可為我們構建新的AS動物模型提供幫助與指導,這對于理解CRP不同亞型在AS發(fā)展過程中的確切功效也有很大幫助。除此之外,通過干預CRP的構象轉換以及mCRP發(fā)揮作用的途徑,也許能夠幫助人們找到治療CVD的有效方法。