王康泓

(深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院,中國廣東 深圳 518060)

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARSCoV-2)感染引起的疾病于2020年2月11日被世界衛(wèi)生組織命名為2019冠狀病毒病(coronavirus disease 2019,COVID-19)[1～2],其蔓延是近 20 年世界范圍內(nèi)第3次冠狀病毒大流行。SARS-CoV-2與SARS-CoV[3]和中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)[4]同為冠狀病毒,但與它們相比,SARS-CoV-2具有傳染性強[5～7]、潛伏期長[6]、人群普遍易感[7]、早期感染癥狀不明顯及存在無癥狀感染者[8]等特點,這些特點將更利于SARS-CoV-2在人群間傳播。多項研究表明,在缺乏人為干預(yù)的條件下,SARSCoV-2的基本再生數(shù)(R0)將高于SARS-CoV和MERS-CoV[5～7],這與目前 SARS-CoV-2 在世界范圍內(nèi)蔓延的現(xiàn)狀相符。此外,SARS-CoV-2可通過密切接觸傳播、飛沫傳播、糞口傳播等多種方式傳播[9～10],豐富的傳播方式使SARS-CoV-2具有更強的適應(yīng)能力,可廣泛流行于不同國家和地區(qū)。截至2020年11月25日,全球范圍內(nèi)超200個國家出現(xiàn)了COVID-19患者58 900 547名,死亡人數(shù)達到1 393 305[11]。盡管COVID-19疫情在我國本土得到了較好的控制,但隨著疫情在世界范圍內(nèi)的流行,防疫工作依舊嚴(yán)峻,對SARS-CoV-2的深入研究仍十分有必要。因此,本文將從SARSCoV-2基因組序列分析及其溯源、由血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)介導(dǎo)的病毒入侵過程和《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》(第三版至第七版)提出的COVID-19現(xiàn)有治療藥物3個方面,對SARS-CoV-2的遺傳特點、傳播方式、感染致病機理及其引起的COVID-19的現(xiàn)有及潛在有效藥物展開綜述。

1 SARS-CoV-2的基因組序列分析及溯源

1.1 SARS-CoV-2的序列分析

基于序列同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育分析的生物信息學(xué)手段在預(yù)測病毒基因組結(jié)構(gòu)及其編碼產(chǎn)物、估算病毒突變速率、追溯病毒起源及其進化等過程中起到重要作用。通過對國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心早期發(fā)布的5株SARS-CoV-2毒株的基因組序列(序列號分別為GWHABKF00000000、GWHABKG00000000、GWHABKH00000000、GWHABKI00000000、GWHABKJ00000000)進行分析可知,SARS-CoV-2基因組全長約29.8 kb,其正鏈編碼12個氨基酸組成數(shù)超過75的蛋白質(zhì)[12]。研究表明,SARS-CoV-2基因組從5′端至3′端的組成順序為 5′非翻譯區(qū)(5′-untranslated region,5′-UTR)、病毒復(fù)制酶系(open reading frame 1ab,ORF-1ab)編碼區(qū)、刺突蛋白(spike protein,S)編碼區(qū)、包膜蛋白(envelope protein,E)編碼區(qū)、膜蛋白(membrane protein,M)編碼區(qū)、核衣殼蛋白(nucleoprotein,N)編碼區(qū)和 3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)[9,13]。值得一提的是,SARS-CoV-2具有典型的β-冠狀病毒的序列末端特征[9]。

針對上述5株SARS-CoV-2的基因組序列的比對結(jié)果顯示,它們在非編碼區(qū)的104、111、112、119、120、124 位及編碼區(qū)的 3 778、6 996、7 866、8 388、8 987位存在核苷酸差異[12],提示SARS-CoV-2基因組中某些位點易發(fā)生突變,且這些突變已出現(xiàn)在早期(2020年1月26日前)分離的毒株中。其他研究結(jié)果顯示,SARS-CoV-2基因組在 6 943、8 737、8 789、11 739、20 646、20 655、24 031、27 469、28 120、28 151、28 299 位存在多個易突變位點[14～15],進一步驗證了該病毒的高突變率[16]。進一步分析可知,除 3 778、6 943、11 739、27 469、28 120位點發(fā)生同義突變外,其余突變位點的核苷酸變化將引起其編碼蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而對蛋白質(zhì)的極性、構(gòu)象、活性產(chǎn)生影響。以上結(jié)果意味著SARS-CoV-2可能在傳播的過程中通過變異產(chǎn)生多種特點各異的毒株,并相應(yīng)地進化出新的傳播途徑和入侵逃逸機制。已有研究發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2通過自然突變引入了一個β-冠狀病毒所不具備的Furin蛋白酶切位點,該變異不但提升了病毒的入侵效率,而且對SARS-CoV-2的入侵機制具有一定影響,使其感染宿主的方式可能更接近于人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)和埃博拉病毒[17]?？深A(yù)見地,針對SARS-CoV-2的藥物及疫苗研發(fā)將因為該病毒的突變而變得更加困難。

此外,基于基因組序列分析結(jié)果進行的SARS-CoV-2分型及病毒變異速率估算的相關(guān)研究也取得了一定的進展。一項以103個SARSCoV-2基因組序列為樣本的群體遺傳學(xué)分析結(jié)果表明,可根據(jù)SARS-CoV-2基因組中8 782位和28 194位這一對關(guān)聯(lián)性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)將該病毒分為S與L兩個亞型;與其他冠狀病毒基因組序列的比對結(jié)果顯示,S型SARS-CoV-2為更古老的毒株;針對不同亞型毒株表達產(chǎn)物的分析結(jié)果顯示,新產(chǎn)生的L型毒株具有更強的傳染性及攻擊性,在疫情流行初期傳播得較為迅速,但隨著“封城”等強力干預(yù)措施的執(zhí)行,毒力較低的S型毒株可能因為其傳播的隱蔽性而得到更廣泛傳播[18]。早期的研究結(jié)果表明,在自然界的冠狀病毒中每個核苷酸每年的平均突變速率約為10-4[15,19]。根據(jù)已有的SARS-CoV-2基因組數(shù)據(jù)推測,該病毒的突變速率為 1.19×10-3～1.31×10-3[20],與同為冠狀病毒屬的SARS-CoV(每個核苷酸每年發(fā)生1.16×10-3～3.30×10-3次同義突變及 1.67×10-3～4.67×10-3次非同義突變)和MERS-CoV(每個核苷酸每年發(fā)生1.12×10-3次突變)具有同一數(shù)量級的突變頻率[21～22],提示SARS-CoV-2與SARS-CoV和MERS-CoV的進化速率大致相同,但快于自然界冠狀病毒的平均進化速率。

綜上所述,SARS-CoV-2基因組序列的解析為病毒基因組結(jié)構(gòu)及各基因表達產(chǎn)物的預(yù)測提供了直接證據(jù),其序列比對結(jié)果在揭示該病毒存在大量易突變位點的同時,也為病毒的分型及進化速率的估算提供了數(shù)據(jù)支持。隨著COVID-19流行時間的增加,SARS-CoV-2將不可避免地產(chǎn)生大量突變。因此,對SARS-CoV-2潛在突變位點進行監(jiān)視并預(yù)測突變后病毒的表型對COVID-19的防控具有指導(dǎo)作用。更重要的是,除了對已明確的L型和S型毒株進行監(jiān)控外,還需進一步檢測是否有毒力更低的新型毒株出現(xiàn)。更具隱蔽性的低毒力毒株可能會造成大批無癥狀感染者的出現(xiàn),并引起COVID-19的二次流行。此外,利用SARS-CoV和MERS-CoV基因表達產(chǎn)物構(gòu)建無復(fù)制能力的高滴度假病毒的研究已經(jīng)取得成功,提示構(gòu)建模擬RNA病毒狀態(tài)的SARS-CoV-2假病毒具有一定可行性[23～24]。假病毒的構(gòu)建可推動SARS-CoV-2的免疫學(xué)研究,為相關(guān)藥物及疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。因此,對SARS-CoV-2序列進行深入研究仍十分必要。

1.2 SARS-CoV-2的溯源

SARS-CoV-2及相關(guān)冠狀病毒的基因組系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,SARS-CoV-2是一種Sarbecovirus亞屬的新型β-冠狀病毒[15]。研究者對同為冠狀病毒屬的SARS-CoV和MERS-CoV進行傳播途徑溯源,發(fā)現(xiàn)它們分別通過蝙蝠-果子貍-人途徑和蝙蝠-駱駝-人途徑進行傳播并最終感染人類[25～27]?；谏鲜鼋Y(jié)果推測SARS-CoV-2很可能也通過“天然宿主-中間宿主-人”的模式進行傳播。

目前,研究者普遍認(rèn)為蝙蝠是SARS-CoV-2的天然宿主。全基因組序列分析結(jié)果顯示,SARSCoV-2與BatCoV RaTG13的基因組相似性高達96%以上,提示SARS-CoV-2大概率起源于蝙蝠[18,28]。另一項基于β-冠狀病毒基因組特有的互補回文序列及其編碼區(qū)的溯源分析結(jié)果顯示,SARS-CoV-2來自于菊頭蝠[26]。盡管目前仍不確定SARS-CoV-2具體源于哪一種蝙蝠,但蝙蝠是該病毒天然宿主的結(jié)論基本沒有爭議。

對于SARS-CoV-2的中間宿主,目前存在較大分歧。Yang等[9]根據(jù)多種動物分離出的冠狀病毒毒株序列的同源性比對結(jié)果得出,蛇與穿山甲是SARS-CoV-2的潛在中間宿主,但Zhang等[29]通過大數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析反駁了蛇是該病毒中間宿主的推斷。盡管SARS-CoV-2與穿山甲冠狀病毒具有較高的同源性[18],但有研究發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2具有穿山甲冠狀病毒所不具備的PRRA肽段,提供了感染人類的SARS-CoV-2并非直接來源于穿山甲的證據(jù)[20]。此外,一項基于密碼子偏好性的研究發(fā)現(xiàn),在SARS-CoV-2基因組中編碼精氨酸的“CGG”密碼子的相對頻率為3.14%,與蝙蝠的2.59%存在一定差距,提示該病毒從天然宿主傳播到人類的過程中存在至少1種利用“CGG”密碼子相對頻率較高的動物作為過渡;該研究團隊根據(jù)SARS-CoV-2檢測陽性的動物樣品及華南海鮮市場交易的動物推斷,狐貍和鹿可能是SARS-CoV-2的中間宿主[17]。

在利用中間宿主作為傳播媒介的同時,冠狀病毒在不同宿主體內(nèi)發(fā)生的遺傳重組將促進其進化,進而產(chǎn)生對人類更具威脅的新表型[9,19]。此外,SARS-CoV-2的長期流行可能使更多的動物成為宿主,從而使其傳播網(wǎng)絡(luò)變得更加復(fù)雜。因此,需要廣泛地對不同國家和地區(qū)在不同時間分離的SARS-CoV-2毒株進行分析,在明確該病毒中間宿主的同時根據(jù)宿主動物的活動軌跡及生活方式進行針對性防控。對SARS-CoV-2檢測呈陽性的動物宜采取人為干預(yù)措施,盡可能切斷病毒的傳播、進化途徑。

2 ACE2介導(dǎo)的病毒入侵機制

2.1 ACE2的組織定位及生物學(xué)功能

刺突蛋白與宿主細(xì)胞表面受體的識別是冠狀病毒侵入靶細(xì)胞的關(guān)鍵。針對SARS-CoV-2刺突蛋白結(jié)構(gòu)模擬計算的結(jié)果顯示,該病毒具有與SARS-CoV相似的受體結(jié)合域(receptor binding domain,RBD),表明SARS-CoV-2也是通過宿主的ACE2侵入靶細(xì)胞[25]。因此,明確ACE2的組織定位及生物學(xué)功能對COVID-19發(fā)病機制的研究及相關(guān)藥物的研發(fā)具有指導(dǎo)作用。

TCGA(The Cancer Genome Atlas)、FANTOM5(Functional Annotation of the Mammalian Genome)等數(shù)據(jù)庫中單細(xì)胞RNA測序的結(jié)果顯示,ACE2在心臟的心肌細(xì)胞、肺泡的Ⅱ型肺泡細(xì)胞(alveolar typeⅡ,AT2)、食道的層狀上皮細(xì)胞、回結(jié)腸的上皮細(xì)胞、腎近端小管細(xì)胞、膀胱及尿路上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中高水平表達[30～31],提示以上多個器官或組織可能成為SARS-CoV-2的潛在感染位點。

ACE2密切相關(guān)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)在人體內(nèi)環(huán)境維持和炎癥反應(yīng)的過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。該系統(tǒng)由ACE-血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)-血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensinⅡtype 1 receptor,AT1R)軸與 ACE2-Ang1～7-Mas(Ang1～7 對應(yīng)的受體)軸組成,且后者對前者具有拮抗作用[32]。在ACE2-Ang1～7-Mas軸中,ACE2作為經(jīng)典RAS系統(tǒng)的拮抗劑,通過降低AngⅡ的水平起到維護心血管功能、對抗炎癥反應(yīng)等作用;Ang1～7可減少巨噬細(xì)胞的浸潤并降低單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎癥因子的水平,在炎癥反應(yīng)的對抗中起重要作用[32]。正常條件下,RAS軸間的活性水平處于動態(tài)平衡,相應(yīng)系統(tǒng)的功能也保持穩(wěn)定[33～34]。若ACE2的水平出現(xiàn)下降,RAS軸間的動態(tài)平衡將因為ACE2拮抗作用的下調(diào)而被打破,ACE-AngⅡ-AT1R軸介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)加重,使機體受到相應(yīng)的炎癥損傷[35]。綜上所述,ACE2作為經(jīng)典RAS軸的抑制劑,可通過減輕ACE-AngⅡ-AT1R介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)降低機體受到的炎癥損傷,最終對相應(yīng)器官或組織起到保護作用。

2.2 ACE2在病毒入侵及COVID-19發(fā)展過程中行使的生物學(xué)功能

冠狀病毒對宿主靶細(xì)胞的感染需先后經(jīng)歷S1蛋白介導(dǎo)的受體結(jié)合過程和S2蛋白介導(dǎo)的膜融合過程[28],前過程中病毒刺突蛋白與細(xì)胞受體的相互作用是病毒得以特異性侵入的關(guān)鍵。針對SARS-CoV感染機制的研究發(fā)現(xiàn),ACE2基因敲除小鼠對SARS-CoV的敏感性較低,該小鼠因感染產(chǎn)生的肺損傷和病毒滴度遠(yuǎn)低于野生型小鼠[36],說明ACE2的表達是SARS-CoV入侵和致病的關(guān)鍵。SARS-CoV-2與SARS-CoV的RBD高度相似,該特征在揭示ACE2是以上兩種病毒的共同入侵靶點的同時,提示了它們可能具有相似的入侵機制和致病機理[25]。因此,ACE2的深入研究可進一步明確病毒入侵所造成的病理生理改變,為COVID-19的診療提供支持。

COVID-19患者的臨床分析結(jié)果顯示,患者在出現(xiàn)發(fā)熱、乏力、干咳、咽痛、腹瀉、呼吸困難及雙肺感染等臨床癥狀的同時伴隨著多種細(xì)胞因子水平升高[5,10,37～39]。包括 IL-1B、IL-RA、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、干擾素-γ (interferon-γ,INF-γ)、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(interferon-inducible protein-10,IP-10)、MCP-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1A(macrophage inflammatory protein 1A,MIP1A)、MIP1B、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、TNF-α、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的升高說明COVID-19患者免疫系統(tǒng)在對抗SARS-CoV-2感染的過程中引發(fā)了炎癥因子風(fēng)暴[34,37]。炎癥因子風(fēng)暴的引發(fā)將進一步造成急性肺損傷乃至器官衰竭,使患者病情迅速惡化[37]。對以上指標(biāo)的進一步分析發(fā)現(xiàn),ACE2下調(diào)造成的RAS系統(tǒng)失衡的相關(guān)炎癥因子 MCP-1、IL-6、TNF-α 參與了 COVID-19 炎癥因子風(fēng)暴的產(chǎn)生。此外,有研究發(fā)現(xiàn)COVID-19患者血漿中AngⅡ的水平明顯升高,且該水平與SARS-CoV-2的滴度及肺損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[37]。

以上研究結(jié)果表明,SARS-CoV-2刺突蛋白與ACE2結(jié)合所產(chǎn)生的一系列病理生理改變是COVID-19發(fā)展的關(guān)鍵。SARS-CoV-2感染后造成的改變?nèi)缦?在SARS-CoV-2感染的初期,病毒的侵入及非特異性免疫系統(tǒng)的激活造成宿主相應(yīng)組織中ACE2下調(diào),與之相關(guān)的RAS軸間的動態(tài)平衡隨之被打破,造成AngⅡ和包括MCP-1、IL-6、TNF-α在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的水平上升;隨著非特異性免疫系統(tǒng)的激活,中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向感染部位募集并活化,在清除感染細(xì)胞的同時釋放相應(yīng)的炎癥因子和趨化因子,并在激發(fā)特異性免疫系統(tǒng)的同時進一步下調(diào)ACE2的表達水平[34～35,38,40]。特異性免疫系統(tǒng)的激活將進一步擴大免疫反應(yīng),引發(fā)炎癥因子風(fēng)暴,最終造成COVID-19患者出現(xiàn)相應(yīng)的臟器病變[34～35]。因此,可嘗試對COVID-19患者血漿的AngⅡ、炎癥因子風(fēng)暴相關(guān)細(xì)胞因子和C反應(yīng)蛋白、乳酸脫氫酶等肺部損傷相關(guān)指標(biāo)進行檢測,并根據(jù)這些指標(biāo)的水平對COVID-19的發(fā)展做出預(yù)判,防止病情惡化[36]。

為進一步揭示ACE2在SARS-CoV-2入侵及COVID-19發(fā)展過程中所行使的生物學(xué)功能,明確受體結(jié)合過程與SARS-CoV-2傳染性、致病性的關(guān)系,研究者開展了針對冠狀病毒刺突蛋白和受體ACE2的分子水平的研究。利用冷凍電鏡對表達純化的S1蛋白開展的生物物理分析顯示,SARS-CoV-2與人ACE2的結(jié)合能力是SARSCoV 的 10～20 倍[41～42]。SARS-CoV-2 和 SARS-CoV的同源性比對結(jié)果顯示,盡管二者同源性高達79%,但在其RBD的6個關(guān)鍵氨基酸殘基中有5個不同,說明SARS-CoV-2與宿主的高親和性與病毒RBD區(qū)域的進化相關(guān)[18,41,43]。進一步的研究分析發(fā)現(xiàn),包括455位亮氨酸殘基、486位苯丙氨酸殘基、493位谷氨酰胺殘基和494位絲氨酸殘基在內(nèi)的多個RBD區(qū)域的氨基酸殘基為病毒與人受體的結(jié)合提供了良好的相互作用;需要指出的是,RBD區(qū)域501位的天冬酰胺殘基與人ACE2的結(jié)合不理想[44]。該結(jié)果說明,SARS-CoV-2的RBD區(qū)域雖然對人ACE2受體具有一定的高親和性,但仍存在一定的進化空間,當(dāng)特定位點的氨基酸殘基突變?yōu)榕c人ACE2親和性更強的殘基時,該病毒的感染能力和傳播速度將進一步提升。

ACE2及冠狀病毒刺突蛋白相關(guān)分子水平的研究也有助于COVID-19潛在治療方法的尋找。SARS-CoV的早期研究顯示,宿主的人腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶(tumor necrosis factor-α converting enzyme,TACE)、絲氨酸蛋白酶TMPRSS2和胰蛋白樣蛋白酶HAT在病毒的入侵過程中起重要作用[45～47]。TACE是SARS-CoV入侵所必需的生物分子,體外細(xì)胞實驗結(jié)果表明,TACE抑制劑TAPI-2可通過阻斷SARS-CoV受體結(jié)合過程中TNF-α產(chǎn)生的細(xì)胞信號降低病毒的感染能力[47～48]。TMPRSS2和HAT對冠狀病毒刺突蛋白的切割為病毒活化所必需,且TMPRSS2對ACE2的切割將進一步促進病毒的進入[46]。位于ACE2受體第697～716位的精氨酸殘基和賴氨酸殘基對TMPRSS2生物學(xué)功能的行使起重要作用,這些殘基的突變將直接造成TMPRSS2對ACE2切割能力的下降[46]。由于SARS-CoV-2刺突蛋白與ACE2的結(jié)合也需要經(jīng)歷上述生物學(xué)過程,因此,對TACE、TMPRSS2和HAT具有抑制作用的相關(guān)藥物可能對COVID-19的治療具有較好的效果。此外,有研究根據(jù)SARS-CoV-2 RBD區(qū)域中保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartate,RGD)基序進行推測,認(rèn)為整聯(lián)蛋白可作為SARS-CoV-2入侵的替代受體,故該蛋白質(zhì)也可能是COVID-19的潛在治療靶點[49]。

3 COVID-19治療藥物的研究進展

3.1 《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》的推薦藥物

國家衛(wèi)生健康委員會于2020年1月15日至3月3日相繼發(fā)布了七部試行版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》(下稱《診療方案》),每一版《診療方案》的修訂均結(jié)合了最新的治療進展,其推薦的參考藥物對COVID-19的治療具有深刻的指導(dǎo)意義。

《診療方案》(試行第三版)在治療COVID-19的推薦藥物上提出了4點建議,分別是α-干擾素的霧化吸入、使用洛匹那韋/利托那韋進行治療、根據(jù)病情的進展使用糖皮質(zhì)激素、根據(jù)基本病機特點推薦相應(yīng)的中藥處方[50]。作為廣譜的抗病毒藥物,α-干擾素可通過誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)和干擾病毒的復(fù)制阻止病毒的增殖[51]。洛匹那韋是一種蛋白酶抑制劑,在艾滋病的治療中得到廣泛應(yīng)用,該藥物通過阻斷Gag-Pol聚蛋白分裂使HIV無法產(chǎn)生有感染力的成熟病毒顆粒;利托那韋可抑制細(xì)胞色素P450A介導(dǎo)的洛匹那韋的快速代謝,提高血漿中洛匹那韋的濃度,二者常聯(lián)合用藥[52]。冠狀病毒基因組編碼的木瓜樣蛋白酶和3C樣蛋白酶是冠狀病毒增殖、侵染等生物學(xué)過程所必需的蛋白酶[53～54],故推測洛匹那韋/利托那韋通過抑制SARS-CoV-2中毒蛋白酶的活性來阻止病毒的增殖和侵染。糖皮質(zhì)激素的使用是一把“雙刃劍”。一方面,糖皮質(zhì)激素具有抗炎、免疫抑制、抗毒素的作用,早期合理的使用可減輕危重癥COVID-19患者的炎癥反應(yīng)[55～56]。另一方面,免疫抑制造成的CD4+淋巴細(xì)胞下降不利于病毒的清除[55],更嚴(yán)重的是,長期大劑量地使用糖皮質(zhì)激素會造成股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松等一系列嚴(yán)重的后遺癥[57～58]。因此,對于糖皮質(zhì)激素的使用仍需要持謹(jǐn)慎的態(tài)度。《診療方案》(試行第四版)在明確洛匹那韋/利托那韋具體用量的同時,提出恢復(fù)期血漿治療、靜脈注射血必凈治療、腸道生態(tài)調(diào)節(jié)劑治療等治療方案[59]。此外,該版《診療方案》在中醫(yī)藥診療上明確了不同分型病人的臨床表現(xiàn),并根據(jù)病情進展的分型推薦了處方[59]?！对\療方案》(試行第五版及其修正版)提出了利巴韋林的使用并對其用量加以修正[60～61]。利巴韋林的三磷酸代謝產(chǎn)物可作為病毒RNA合成的底物摻入到新合成的病毒基因組中,從而通過引發(fā)病毒的致死突變來抑制病毒的增殖[51]?！对\療方案》(試行第六版)在納入阿比多爾和磷酸氯喹等推薦藥物的同時,進一步明確了中西醫(yī)結(jié)合的治療方針[62～63]。阿比多爾是一種膜融合抑制劑,該藥物可能通過阻止SARS-CoV-2與人細(xì)胞膜的融合來阻斷病毒的入侵[51]。磷酸氯喹屬于氨基喹啉類抗瘧藥物,可能通過干擾ACE2末端的糖基化和上調(diào)病毒膜融合過程的pH值來抑制SARS-CoV-2的感染;該藥物的初步臨床試驗結(jié)果表明,磷酸氯喹在COVID-19的治療中發(fā)揮了一定的作用[51,64]?！对\療方案》(試行第七版)在進一步明確磷酸氯喹用量的同時提出,利用托珠單抗抑制IL-6引起的炎癥因子風(fēng)暴,以減輕炎癥因子風(fēng)暴造成的病情惡化[65～66]。

結(jié)合了最新治療進展的《診療方案》(試行第七版)對國內(nèi)COVID-19的治療具有深刻的指導(dǎo)作用。隨著疫情在全球范圍內(nèi)的蔓延和國外對COVID-19研究的深入,其他國家發(fā)布的“診療指南”也具有一定的參考價值[67]。疫情在不同國家和地區(qū)的長時間流行,使得SARS-CoV-2因各地區(qū)環(huán)境及中間宿主的差異而進化出特點不同的新毒株。對其他國家的診療指南進行關(guān)注,可提前明確這些輸入型新毒株的特點,并結(jié)合該地區(qū)的治療方案對其引發(fā)的COVID-19進行治療。此外,隨著藥物篩選及新藥研發(fā)等工作的深入,國外“診療指南”中應(yīng)用的藥物也將為本土COVID-19的治療提供更多的備選。

3.2 針對ACE2和毒蛋白酶等靶點的潛在藥物

受體ACE2的存在和病毒基因組編碼的毒蛋白酶生物學(xué)功能的行使是SARS-CoV-2得以入侵、增殖的關(guān)鍵。目前,針對ACE2受體和病毒毒蛋白酶等靶點的天然、人工合成藥物在抑制SARSCoV的研究中取得了一定進展[68]。奈非那韋、纈氨霉素、氯硝柳胺、金精三羧酸、吲哚美辛等針對木瓜樣蛋白酶和3C樣蛋白酶的蛋白酶抑制劑在體外對SARS-CoV具有一定的抑制作用[69]。一項基于化學(xué)遺傳學(xué)的研究對50 240個小分子進行了篩選,并初步鑒定出104種具有潛在抗SARSCoV活性的小分子;進一步分析發(fā)現(xiàn),化合物MP576、VE607分別對SARS-CoV的毒蛋白酶活性和病毒與ACE2的結(jié)合起抑制作用,而且體外活性鑒定結(jié)果顯示,上述化合物具有一定的抗SARS-CoV能力[70]。利用丙氨酸掃描技術(shù)對ACE2的帶電氨基酸殘基進行分析發(fā)現(xiàn),ACE2的第26位和第30位氨基酸殘基對SARS-CoV與ACE2的結(jié)合十分重要[71];基于此,該研究團隊合成了一系列可能具有抗SARS-CoV的肽段,結(jié)果顯示,由ACE2的第22～44位氨基酸殘基組成的肽段和由ACE2第22～57位氨基酸殘基組成的肽段具有明顯的抗SARS-CoV活性,由ACE2第22～44位氨基酸殘基和第351～357位氨基酸殘基連接而成的肽段具有更加顯著的抗病毒能力[71]。

以上結(jié)果表明,包括小分子化合物和抗生素在內(nèi)的蛋白酶抑制劑可能通過抑制冠狀病毒基因組編碼的木瓜樣蛋白酶和3C樣蛋白酶的催化活性來阻止病毒的增殖;具有與人ACE2功能性殘基相似組成結(jié)構(gòu)的人工肽可與病毒提前結(jié)合,通過阻斷受體與病毒RBD區(qū)域的相互作用而達到抗病毒的效果。綜上所述,基于ACE2和病毒毒蛋白酶等靶點的天然、人工合成藥物可能成為COVID-19治療的“特效藥”,但鑒于SARS-CoV-2基因組的特異性,相關(guān)潛在藥物的開發(fā)仍需要經(jīng)歷漫長的探索過程。

3.3 來源于中藥的潛在活性成分

多項針對COVID-19患者進行的回顧性研究指出,中西醫(yī)結(jié)合治療能顯著改善COVID-19患者的臨床癥狀,在縮短輕重癥患者治療時間的同時降低重癥的發(fā)生概率[5,72～73]。

隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展,基于TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、GeneCards、STRING、Enrichr、WebGestalt(WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit)等數(shù)據(jù)庫進行的一系列藥物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、核心靶點和通路的篩選分析以及化合物分子對接模擬是目前對傳統(tǒng)藥方中潛在活性成分進行篩選的重要手段[74～75]。研究者可根據(jù)生物利用度、類藥性等條件在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取藥方的活性成分及藥物作用的靶點;在OMIM、GeneCards等數(shù)據(jù)庫中獲取COVID-19相關(guān)靶點并構(gòu)建相應(yīng)的藥理網(wǎng)絡(luò);隨后通過STRING等數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),并進一步利用 Enrichr、WebGestalt等數(shù)據(jù)庫進行 GO(Gene Ontology)功能富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)生物通路富集分析[75～81]。經(jīng)上述一系列分析可預(yù)測藥方中的潛在有效化合物及其相應(yīng)的調(diào)控靶點、相關(guān)通路等信息,并最終預(yù)測出最具治療價值的核心成分。

目前,相關(guān)研究已對清肺排毒湯[75]、三消飲[76]、麻杏石甘湯[77]、藿香正氣湯[78]、黃連解毒湯[79]等多個傳統(tǒng)藥方進行了相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。研究結(jié)果表明,上述藥方可能通過維持RAS相關(guān)通路的平衡、抑制補體系統(tǒng)激活、抑制炎癥反應(yīng)、參與免疫調(diào)節(jié)、抑制SARS-CoV-2 3C樣蛋白酶活性和抑制ACE2與病毒的結(jié)合過程等多個方面抑制COVID-19的發(fā)展,揭示了中藥在COVID-19治療中發(fā)揮的多成分、多靶點、多通路的作用特點。

4 結(jié)語

SARS-CoV-2具有潛伏期長、傳染性強、人群普遍易感和傳播方式多樣等特點。隨著全球范圍內(nèi)COVID-19患者的持續(xù)上升,SARS-CoV-2的全球大流行已不可避免。更嚴(yán)重的是,從該病毒的特點和已有的抗病毒策略來看,距SARS-CoV-2的特效藥物和相關(guān)疫苗的成功研發(fā)仍有一定距離。綜上所述,對SARS-CoV-2的傳播進行預(yù)防仍是現(xiàn)階段阻止COVID-19蔓延的最有效方法。SARS-CoV-2的傳播方式提示:防止含病毒顆粒的飛沫及氣溶膠的接觸或吸入是阻止該病毒感染的關(guān)鍵[82]。因此,可通過佩戴醫(yī)用外科口罩及手部清潔等措施減少含病毒顆粒物質(zhì)的接觸與吸入;對于存在人員流動的密閉空間,可使用乙醚、75%乙醇、氯仿等消毒劑對病毒滅活[83]。此外,隨著復(fù)工復(fù)產(chǎn)工作的有序推進,完善疫情信息的監(jiān)測更新、加快疑似病例的診斷等對現(xiàn)階段所面臨的聚集性疫情及院內(nèi)感染的防止具有重要意義[7]。

盡管目前對SARS-CoV-2的基因組及其傳播途徑有了初步的認(rèn)識,但隨著疫情在不同國家與地區(qū)的長時間流行,病毒不但會在人與人傳播的過程中發(fā)生變異,而且“天然宿主-中間宿主-人”理論傳播網(wǎng)絡(luò)也將不可避免地因為其他物種的感染而變得更加復(fù)雜。不同中間宿主所介導(dǎo)的遺傳重組將導(dǎo)致更多特點各異的毒株產(chǎn)生,使相關(guān)藥物及疫苗的研發(fā)變得更加困難。因此,對不同地區(qū)、不同時間段出現(xiàn)的毒株進行分離測序,對明確病毒的進化方向、尋找并切斷病毒的進化傳播途徑具有重要意義。

針對ACE2及SARS-CoV-2刺突蛋白的研究表明,病毒刺突蛋白與受體結(jié)合后引發(fā)的一系列免疫反應(yīng)和病毒本身造成的病理后果是COVID-19發(fā)展的關(guān)鍵。有關(guān)上述過程的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)的深入研究將進一步揭示SARS-CoV-2的傳播、致病機制,為COVID-19控制及潛在藥物的尋找提供思路。

《診療方案》推薦的藥物結(jié)合了疫情發(fā)展過程中最新的研究進展,是目前COVID-19治療中最可行有效的“武器”。隨著SARS-CoV-2研究及相關(guān)藥物臨床試驗的深入,潛在藥物將得到進一步發(fā)掘[84],從而為COVID-19的治療提供更多備選藥物。

此外,COVID-19患者存在康復(fù)后復(fù)發(fā)和無癥狀感染等現(xiàn)象。一項基于3例COVID-19出院后核酸檢測結(jié)果復(fù)陽患者的回顧性研究指出,在患者感染初期,SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的核酸檢測結(jié)果呈雙基因強陽性,而二次入院時的報告顯示雙基因弱陽性,提示核酸檢測結(jié)果復(fù)陽患者的病毒載量遠(yuǎn)低于其首次入院時的病毒載量[85]。另一項回顧性研究指出,COVID-19患者存在治愈后復(fù)發(fā)且病程與臨床癥狀、實驗室指標(biāo)和影像學(xué)表現(xiàn)不同步的現(xiàn)象[86]。也有研究發(fā)現(xiàn),COVID-19患者在病癥消失后的一段時間內(nèi)仍可檢測出病毒的RNA[87～88]。以上信息提示,COVID-19患者康復(fù)后復(fù)發(fā)可能與以下因素相關(guān):第一,SARSCoV-2在體內(nèi)的增殖存在消長過程,核酸檢測的結(jié)果與病程不同階段的核酸載量有關(guān)[86];第二,患者癥狀消失后SARS-CoV-2的排毒仍在繼續(xù),患者體內(nèi)仍攜帶有較低滴度的病毒;第三,核酸檢測試劑的靈敏度、實驗人員的操作手法、環(huán)境和唾液中的RNA酶導(dǎo)致病毒核酸降解及患者口腔、鼻咽部病毒量低等原因造成核酸檢測漏檢及假陰性,使部分患者在痊愈前出院,導(dǎo)致復(fù)發(fā)[89]。一項基于72 314例COVID-19患者的流行病學(xué)調(diào)查顯示,樣本中約存在1%(889例)的無癥狀感染者[90]。傳染病中存在無癥狀感染者的現(xiàn)象已得到廣泛認(rèn)可,COVID-19患者中無癥狀感染者的出現(xiàn)可能與人類基因的多態(tài)性、不同個體的抵抗力、不同毒株的毒力差異和處于潛伏期感染者被快速篩查等因素相關(guān)[91]。