曹喜紅

天津市武清區(qū)食品藥品檢驗所 (天津 301700)

幽門螺桿菌是導(dǎo)致慢性胃炎及消化性潰瘍等疾病的主要原因。目前，幽門螺桿菌已被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌源[1]?？死顾厥桥R床常用的抗幽門螺桿菌藥物，為一線治療藥物，在臨床治療中取得了顯著的效果[2]。近年來，隨著克拉霉素在臨床的廣泛應(yīng)用，幽門螺桿菌對其耐藥性不斷增強，進而使治療效果大打折扣[3]。因此，有必要開展幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性檢測。

1 幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥機制

2012年，馬斯特里赫特Ⅳ-佛羅倫薩共識報告中明確表示，對于克拉霉素耐藥性超過15%的地區(qū)，在應(yīng)用克拉霉素治療幽門螺桿菌相關(guān)疾病前應(yīng)首先開展細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗。目前，人們已基本明確了幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥的分子機制?？死顾乜褂拈T螺桿菌治療的主要機制為其可與23SrRNA分子V功能域內(nèi)轉(zhuǎn)肽酶進行結(jié)合進而對幽門螺桿菌蛋白質(zhì)的合成進行抑制[4]。但是，23SrRNA分子V功能域內(nèi)在治療過程中出現(xiàn)的點突變會逐漸降低對克拉霉素的親和力，進而阻礙克拉霉素與23S核糖體亞基進行結(jié)合，產(chǎn)生耐藥性[5]。

2 傳統(tǒng)檢測方法

傳統(tǒng)幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性的檢測方法主要是分離培養(yǎng)-藥敏試驗方法，這是被學(xué)術(shù)界公認(rèn)的幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。在采用分離培養(yǎng)-藥敏試驗開展幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性檢測的過程中，如果培養(yǎng)液質(zhì)量不合格及標(biāo)本放置時間過長，或者培養(yǎng)環(huán)境達(dá)不到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)時，會在很大程度上影響檢測效果[7]。同時，該方法對操作技術(shù)要求較高，費用昂貴，且不能對Hp耐藥突變點位進行有效檢測，難以在臨床檢驗診斷中推廣應(yīng)用。

3 分子生物學(xué)檢測方法

針對傳統(tǒng)分離培養(yǎng)-藥敏試驗幽門螺旋桿菌對克拉霉素耐藥性檢測存在的問題，有學(xué)者提出了分子生物學(xué)檢測方法。分子生物學(xué)檢測方法的主要原理為通過采用分子生物學(xué)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)來檢測幽門螺桿菌23rRNA基因突變情況，進而對幽門螺桿菌關(guān)于克拉霉素的耐藥性做出判斷。在既往的研究中，已經(jīng)形成了DNA芯片、PCR線性探針分析、肽核酸-熒光原位雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性、3’錯配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以及DNA測序等一系列成熟的技術(shù)。

3.1 DNA芯片

DNA芯片技術(shù)又被稱之為DNA微陣列技術(shù)，其主要原理為采用支持物對很多特定的DNA片段進行有規(guī)律的排列，然后采用熒光探針對已經(jīng)標(biāo)定的待測序列與支持物上的DNA片段進行雜交，并對雜交后的結(jié)果采用熒光檢測系統(tǒng)進行分析，最終獲得相應(yīng)的定性及定量分析結(jié)果?；蛐酒夹g(shù)具有較高的靈敏性，可重復(fù)檢測，并且可以對多種抗生素及多位點突變進行同時檢測，大大提高了檢測效率[8]。通常來說，基因芯片技術(shù)的DNA測序結(jié)果可達(dá)到95%以上的一致性?；蛐酒夹g(shù)的不足之處在于檢測費用昂貴，難以在臨床檢測中得到推廣。

3.2 PCR線性探針分析

關(guān)于幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性的PCR線性探針檢測的主要步驟：首先，對引物采用生物素進行標(biāo)記；其次，通過PCR技術(shù)對目的基因序列進行擴增進而達(dá)到生物素化的擴增產(chǎn)物，也就是所謂的探針已經(jīng)標(biāo)記的待測核酸，然后將其與在NC膜上固定的未標(biāo)記的特殊寡聚核苷酸探針進行雜交處理；最后，采用放射自顯影技術(shù)對NC膜上是否存在互補的核酸分子進行判斷。采用PCR線性探針分析方法對石蠟包埋的胃黏膜標(biāo)本進行檢測的靈敏度和特異度較高，因此該技術(shù)對于大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性的檢測可信度較高[9]。但是，目前受到探針的限制，該方法只能有效檢測到7種突變基因。

3.3 肽核酸-熒光原位雜交

采用肽核酸-熒光原位雜交對幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性進行檢測的主要原理：首先，對DNA探針采用已經(jīng)特殊修飾的核苷酸分子進行標(biāo)記，并將其與完整細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)序列開展原位雜交；其次，采用將探針分子與熒光素分子耦聯(lián)的單克隆抗體開展特異性結(jié)合；最后，通過熒光顯微鏡對熒光探針互補的核酸序列進行檢測[10]。相對于PCR線性探針分析技術(shù)來說，肽核酸-熒光原位雜交技術(shù)不需要大量的待測核酸，并且檢測更快速，檢測結(jié)果更精確。同時，肽核酸-熒光原位雜交技術(shù)由于采用的是PNA探針，因此DNA探針能較好地與目標(biāo)基因進行雜交，并且不存在靜電排斥問題[11]。但是該方法具有一定的侵入性，不適用于老年人及兒童。

3.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度分析技術(shù)

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度分析技術(shù)對幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性進行檢測的主要原理：首先，采用PCR技術(shù)對目的基因進行擴增處理；其次，對擴增產(chǎn)物采用特異性限制性內(nèi)切酶進行酶切，對酶切產(chǎn)物開展電泳遷移率變動分析；最終，觀察電泳圖譜對是否存在變異性進行判斷[12]。該技術(shù)具有較高的檢測特異度和靈敏度，在臨床幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性檢驗中被廣泛應(yīng)用。

3.5 3’錯配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

3’錯配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性的基本原理：采用Cla18及Cla3等特異性引物在PCR擴增反應(yīng)中進行反應(yīng)，如果發(fā)生3’末端錯配容易導(dǎo)致擴增產(chǎn)物的降低，產(chǎn)生片段基因，進而對突變型及野生型進行區(qū)分[13]。采用3’錯配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)可以對HP 23S rRNA A2142C位點突變進行有效檢測。從整體上來說，3’錯配聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)相比聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度分析技術(shù)具有更高的檢測特異度和靈敏度[14]。

3.6 DNA測序技術(shù)

DNA測序技術(shù)是目前分子生物學(xué)檢測方法中的金標(biāo)準(zhǔn)，可對幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性進行有效檢測。該技術(shù)的優(yōu)勢在于檢測過程更為直接，檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確，可同時開展多耐藥突變的檢測[15]。但是，該技術(shù)儀器設(shè)備較為昂貴，通過在檢測過程中容易出現(xiàn)模板濃度不當(dāng)以及引物設(shè)計不合理的情況。目前，臨床主要應(yīng)用該技術(shù)來對其他檢測方法的可靠性進行驗證，以及用來發(fā)現(xiàn)新的其他未知突變。

4 小結(jié)

近年來，由于幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性的不斷增強，導(dǎo)致克拉霉素治療效果逐漸下降。因此，開展幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥情況對于制定更積極有效的治療方案具有重要意義。目前，關(guān)于幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥性檢測有一系列分子生物學(xué)檢測方法，雖然部分分子生物學(xué)檢測方法由于費用昂貴等原因尚未在臨床檢測中得到推廣應(yīng)用，但隨著后續(xù)研究的不斷深入，分子生物學(xué)檢測將會在幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性檢測中取得更為顯著的效果。