方馬一佳，萬海同，潘璐佳，鄭艷秋，何 昱

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

腦缺血在臨床腦血管疾病中最為常見，約占80%，它具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響人類的健康，但目前仍缺乏有效的治療藥物［1］。

腦缺血是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，中醫(yī)學(xué)上歸屬于“中風(fēng)”的范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為，血瘀是缺血性中風(fēng)的病理核心，而氣虛為根源，因此治療方法常以益氣活血法為主［2-3］。

從現(xiàn)代藥理學(xué)角度出發(fā)，黃芪、紅花中的許多組分均對(duì)腦缺血損傷有較好的治療作用，如黃芪甲苷能通過降低缺血腦組織的自由基水平、提高超氧化物歧化酶等達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用［8-9］；紅花中的主要成分羥基紅花黃色素A可以通過保護(hù)腦組織、抗血小板聚集等發(fā)揮抗腦缺血的作用［10］。

基于中藥多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以從整體上對(duì)藥物以及疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，更直觀地理解藥物與機(jī)體的相互作用關(guān)系［11］，從而在分子層面闡明成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)之間的潛在關(guān)系。因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，為進(jìn)一步揭示黃芪-紅花治療腦缺血的作用機(jī)制，探討其配伍關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要活性成分及成分靶點(diǎn)的收集 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：／／lsp.nwsuaf.edu.cn）是一個(gè)非常全面的中藥成分系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫，主要用于化學(xué)成分的查找［12］。在該數(shù)據(jù)庫中分別以“紅花”“黃芪”為關(guān)鍵詞搜索化學(xué)成分，檢索到紅花中化合物共189 個(gè)，黃芪中化合物89 個(gè)。然后根據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫的建議及參考其他文獻(xiàn)［13］，以口服利用度（OB）≥30% 和類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，最后篩選得紅花成分22 個(gè)，黃芪成分20 個(gè)。雖然篩選過程中紅花中的羥基紅花黃色素A、紅花黃色素因OB＜30%不符合篩選條件，但經(jīng)文獻(xiàn)查找，該成分對(duì)治療腦缺血確有作用，如羥基紅花黃色素A 預(yù)防及治療給藥均可以減少SD 大鼠腦缺血半暗帶區(qū)HSP70 蛋白的表達(dá)［14］，紅花黃色素對(duì)控制性低血壓誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可降低死亡率［15］，因此也將其計(jì)入。此外，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用目前全球最大的中醫(yī)藥小分子數(shù)據(jù)庫之一，即TCM 數(shù)據(jù)庫（http：／／tcm.cmu.edu.tw／）［16］，同樣以“紅花”“黃芪”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索。將2 個(gè)數(shù)據(jù)庫中的化學(xué)成分去除重復(fù)項(xiàng)后整理于Excel 表格上。

通過STITCH 數(shù)據(jù)庫［17］，將Organism 設(shè)定為Homo sapiens，對(duì)成分靶點(diǎn)進(jìn)行收集。

1.2 疾病靶點(diǎn)的收集 OMIM 數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man；http：／／www.omim.org）為用于描述人類遺傳病以及基因研究的知識(shí)庫［18］，TTD 數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database；https：／／db.idrblab.org／ttd／）是可以提供已知的包括未知的正在探索的治療蛋白以及核酸目標(biāo)信息的數(shù)據(jù) 庫［16］，DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：／／www.drugbank.ca／）則包含有藥物、藥物靶點(diǎn)、分子信息的生物信息學(xué)和化學(xué)信息［19］。分別在這3 個(gè)數(shù)據(jù)庫內(nèi)以“cerebral ischemic stroke”“cerebral infarction”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集與腦缺血相關(guān)的靶點(diǎn)，去除重復(fù)項(xiàng)后整理于Excel 上。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)參考文獻(xiàn)中所述方法［20］，利用Cytoscape 3.6.1 軟件分別構(gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、成分靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)、疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)、成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。在構(gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)時(shí)，將整理所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件即可；在構(gòu)建成分靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)和疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)時(shí)，選擇Bisogenet 插件，將方法設(shè)置為“Input nodes and its neighbors”，參數(shù)為1，輸出方式為基因；在構(gòu)建成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)時(shí)，將方法改為“Input nodes only”，其余不變。最后利用其中的Merge 功能，將相互作用網(wǎng)絡(luò)合并，取交集部分，最終獲得黃芪-紅花中治療腦缺血的候選靶點(diǎn)。

1.4 通路整合與分析 將獲得的候選靶點(diǎn)導(dǎo)入MAS 3.0（http：／／bioinfo.capitalbio.com）在線分析工具［21］，進(jìn)行基因本體生物學(xué)過程GO（gene ontology biology process）富集分析以及基因組百科全書KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路注釋分析［22］，繪制條形圖。

賽珍珠女士(Pearl S.Buck)將中國名著《水滸傳》的書名譯為《All Men Are Brothers》，單從字面看覺得該翻譯沒有表達(dá)出原著的意圖，但是譯者考慮到無法用“water”直譯“水”，“滸”指“水邊，離水稍遠(yuǎn)的岸上陸地”(waterside)，“傳”可譯為“novel”，如果只是將中文對(duì)應(yīng)的英文串聯(lián)起來則毫無意義。因此，譯者有意識(shí)地誤譯讓外國讀者從書名也可以猜測出該著作有關(guān)俠義之事。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)成分、疾病靶點(diǎn)的收集 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中黃芪20 個(gè)，紅花22 個(gè)；TCM 數(shù)據(jù)庫中黃芪22 個(gè)，紅花22 個(gè)。利用STITCH 數(shù)據(jù)庫對(duì)這些化合物以及文獻(xiàn)查找所得的化合物（羥基紅花黃色素A、紅花黃色素）進(jìn)行成分靶點(diǎn)收集，其中共計(jì)有靶點(diǎn)的化合物為36 個(gè)，對(duì)應(yīng)的成分靶點(diǎn)共176 個(gè)。見表1。

以cerebral ischemic stroke、cerebral infarction 為關(guān)鍵詞在OMIM、TTD、DrugBank 這3 個(gè)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲得相關(guān)疾病的靶點(diǎn)共164 個(gè)。

2.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.2.1 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 將整理于Excel 上的成分以及成分靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件，共得到節(jié)點(diǎn)203 個(gè)，邊255條，見圖1。并將成分及成分靶點(diǎn)進(jìn)行度值（Degree）評(píng)價(jià)，選擇了排名靠前的10 條，其中2 者的共同成分kaempferol（山柰酚）、quercetin（槲皮素）、γ-sitosterol（γ-谷甾醇）度值較高，靶點(diǎn)中CASP3 度值最高，見表2。

表1 成分及對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)目

圖1 黃芪-紅花藥對(duì)的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 成分及成分靶點(diǎn)度值

2.2.2 成分靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 在成分靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，共有節(jié)點(diǎn)（即相互作用蛋白）5 586 個(gè)，邊（即相互作用關(guān)系）139 089 條。見圖2。

圖2 黃芪-紅花藥對(duì)成分靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2.3 疾病靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 在疾病靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，共有節(jié)點(diǎn)（即相互作用蛋白）5 506 個(gè)，邊（即相互作用關(guān)系）119 789 條。見圖3。

圖3 腦缺血相關(guān)靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2.4 成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 在該網(wǎng)絡(luò)中，共有節(jié)點(diǎn)（即相互作用蛋白）328 個(gè)，邊（即相互作用關(guān)系）815 條。見圖4。

圖4 黃芪-紅花藥對(duì)成分靶點(diǎn)和腦缺血相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2.5 網(wǎng)絡(luò)合并 對(duì)3 個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)合并，共獲得節(jié)點(diǎn)172 個(gè)，即黃芪-紅花藥對(duì)治療腦缺血的候選蛋白共172 個(gè)，見圖5。對(duì)候選靶點(diǎn)進(jìn)行度值（Degree）評(píng)價(jià)，選出靠前的10 條，見表3。

圖5 黃芪-紅花藥對(duì)治療腦缺血的候選靶點(diǎn)

表3 部分候選靶點(diǎn)的度值

2.3 通路整合分析 GO 富集分析包括3 個(gè)分支，分子功能、生物過程、細(xì)胞組成［23］。GO 分析結(jié)果顯示，在分子功能方面，黃芪-紅花藥對(duì)主要通過蛋白結(jié)合、ATP 結(jié)合、核苷酸結(jié)合等對(duì)腦缺血產(chǎn)生影響；在生物過程方面，主要是抗凋亡、蛋白氨基酸、磷酸化等。其中P值越小，該基因在GO 中富集越多。見圖6。

圖6 黃芪-紅花藥對(duì)候選靶點(diǎn)的部分GO 富集分析

為了進(jìn)一步闡明候選靶點(diǎn)與哪些通路有關(guān)，還進(jìn)行了KEGG 通路分析。在靠前的20 條中，包括11 條疾病通路及8 條信號(hào)通路（MAPK、ErbB、Toll 樣受體、脂肪細(xì)胞因子、GnRH、T 細(xì)胞受體、Fc epsilonRI、p53 信號(hào)通路）。見圖7。

圖7 黃芪-紅花藥對(duì)候選靶點(diǎn)的部分KEGG 通路分析

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)這兩個(gè)角度來闡明疾病的發(fā)生發(fā)展的一種研究方法，通過對(duì)中藥成分及作用靶點(diǎn)的收集，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步考察中藥對(duì)不同信號(hào)的調(diào)節(jié)作用，從而揭示中藥作用的機(jī)制［24-25］。本研究探討黃芪-紅花藥對(duì)治療腦缺血的機(jī)制，也是在它們的多成分與機(jī)體疾病的多靶點(diǎn)的非線性的相互作用關(guān)系的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。

本次研究，從黃芪-紅花中共收集到36 個(gè)化合物，176個(gè)成分靶點(diǎn)，從圖1 和表1 中可以看出kaempferol（山柰酚）、quercetin（槲皮素）、γ-sitosterol（γ-谷甾醇）作為2者的共同成分，不僅所對(duì)應(yīng)的成分靶點(diǎn)相對(duì)較多，而且度值也相對(duì)較高，這表明它們可能是該藥對(duì)在抗腦缺血方面發(fā)揮作用的重要成分。此外，CASP3 作為黃芪-紅花中的一個(gè)共同靶點(diǎn)，它的度值最高，為10，有研究表明caspase-3作為caspase 家族中熱點(diǎn)研究的蛋白，在腦缺血再灌注損傷中的作用也備受關(guān)注，是啟動(dòng)缺血腦區(qū)受損神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［26］。

在對(duì)篩選得到的172 個(gè)候選靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析和KEGG分析時(shí)，從GO 分析的結(jié)果來看（圖6），在分子功能方面蛋白結(jié)合P值最小，與腦缺血關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)存在于正常大鼠的腦組織內(nèi)的血紅素結(jié)合蛋白（HPX）可以清除有害的游離血紅素，當(dāng)發(fā)生腦缺血后，HPX 的表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮腦保護(hù)的作用［27］。又如當(dāng)纖維蛋白原等凝血因素明顯升高時(shí)，會(huì)使人體內(nèi)的凝血及纖溶機(jī)制發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致腦血栓的形成，加重腦缺血［28］。

除此之外，細(xì)胞凋亡這一生物過程也對(duì)腦缺血有一定的影響。有研究表明，在腦中風(fēng)早期，神經(jīng)細(xì)胞以壞死為主，其后以凋亡為主，并且在大鼠局灶性腦缺血的模型中都發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重的神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象［29］。而從黃芪-紅花藥對(duì)中篩 選出來的172 個(gè)候選靶點(diǎn)中，NOS［30］、COX［31］、CASP［26］等均與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

在進(jìn)行KEGG 通路注釋分析時(shí)（圖7），MAPK 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路這幾條通路P 值較小，被顯著富集。其中MAPK 信號(hào)通路被認(rèn)為是最主要的信號(hào)通路。MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)在缺血、缺氧等病理?xiàng)l件的刺激下可被激活，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)腦缺血后有神經(jīng)保護(hù)作用［32］，侯昆［33］通過實(shí)驗(yàn)說明P38 MAPK 被抑制后，小鼠的神經(jīng)功能得到修復(fù)，對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用。

Toll 樣受體信號(hào)通路中的TLR4 有介導(dǎo)腦缺血損傷作用，當(dāng)TLR4 被阻斷后能抑制TNFα、IL-1β、iNOS 等炎性因子的表達(dá)，因此，阻斷TLR4 抗體可對(duì)腦缺血起到神經(jīng)保護(hù)功能［34］。

雖然在預(yù)測到的通路中，ErbB 信號(hào)通路，在劉楠等［20］對(duì)補(bǔ)陽還五湯進(jìn)行腦缺血作用機(jī)制的研究中也有報(bào)道，但主要通路與補(bǔ)陽還五湯中所報(bào)道的PI3K／Akt 通路不同。雖同為治療腦缺血，但在補(bǔ)陽還五湯中除了黃芪紅花外，還有當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍、赤芍相配伍，其中的當(dāng)歸可以通過激活PI3K／Akt 通路調(diào)節(jié)人內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，在動(dòng)脈粥樣硬化及相關(guān)心腦血管疾病的治療中具有重大價(jià)值［35］，川芎中的主要成分川芎嗪則可以通過該通路對(duì)心肌缺血性損傷起到保護(hù)作用［36］。而在本次研究中，只有紅花黃芪相配伍，紅花中的主要成分羥基紅花黃色素A 能通過MAPK 通路改善大鼠腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能損傷，從而起到腦缺血的治療作用［37］，黃芪中的黃芪多糖也能通過MAPK 通路減少人微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注中NF-kB 的表達(dá)，進(jìn)而抑制再灌注損傷中部分黏附因子的表達(dá)［38］。故而可以推測黃芪-紅花治療腦缺血，MAPK 通路是其關(guān)鍵機(jī)制之一。

除上述3 條通路外，還有脂肪細(xì)胞因子、GnRH、T 細(xì)胞受體、Fc epsilonRI 和p53 信號(hào)通路，其中p53 信號(hào)通路與腦缺血的關(guān)系報(bào)道較多，有研究表明在多種腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭衟53 表達(dá)上調(diào)，并作為一種促凋亡因子發(fā)揮作用，此外，p53 表達(dá)下調(diào)后能有效減少梗死面積［39］。其他通路現(xiàn)有的文獻(xiàn)研究報(bào)道較少，可以在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探討。

此外，黃芪、紅花在抗腦缺血靶點(diǎn)上有著較大的重復(fù)性，如CASP3、TLR4、APOB、AKT1 等均為共同靶點(diǎn)，在這其中CASP3 的度值最高為10，說明了CASP3 可能是黃芪-紅花藥對(duì)中相對(duì)重要的靶點(diǎn)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測出了黃芪-紅花治療腦缺血的主要機(jī)制，但由于數(shù)據(jù)庫的信息尚不夠完全，該研究還有一些局限性，需要在今后的研究中進(jìn)一步闡明黃芪-紅花中活性成分的作用靶點(diǎn)，使機(jī)制的探討更為全面。