孫文杰，陳亞峰，李紅昌，劉 歡，李 劼，曹亦軍，陳 騰，奉典旭

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海 200062）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是胰腺的急性炎癥反應(yīng)，因其往往會影響多個器官功能，現(xiàn)在越來越多專家認(rèn)為AP 是一種全身性疾病，并且有20%～30%的AP 患者病情惡化為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）［1］，造成多個器官的功能障礙。肝損傷是SAP 常見的并發(fā)癥之一，臨床回顧性觀察分析顯示［2］，肝衰竭是SAP 患者死亡的主要影響因素之一，因此對SAP 合并肝損傷的防治有著較大意義。

程序性壞死作為一種可以引發(fā)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞死亡方式，其主要是在TNF-α 誘導(dǎo)下，由受體相互作用蛋白3（receptor-interacting protein3，RIP3）進(jìn)行調(diào)控［3］。近年來研究表明，程序性壞死主要執(zhí)行蛋白RIP3 在急性肝損傷中也起著重要作用［4-5］，其可以通過多種途徑加劇肝損傷。

大承氣湯是中醫(yī)經(jīng)典的通里攻下方劑，源自漢代《傷寒論》，由大黃（君）、芒硝（臣）、枳實(shí)（佐使）、厚樸（佐使）組成，主要用于治療一些腹部疼痛性疾病。大承氣湯對A P 的治療作用已在臨床及基礎(chǔ)研究中得到驗(yàn)證，并且基于該方臨床還研究出一些類方［6］。近年來也有專家探討大承氣湯或大黃主要成分在防治SAP 引起肝損傷中的作用［7-8］，進(jìn)一步擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。課題組前期發(fā)現(xiàn)，在SAP 動物及細(xì)胞模型中，大承氣湯可以通過干預(yù)胰腺腺泡細(xì)胞程序性壞死來減輕胰腺損傷，近期研究發(fā)現(xiàn)，大承氣湯在防治SAP 加重過程中，也可以通過抑制RIP3-MCP1 信號通路減輕SAP 合并的肝損傷。

1 材料

1.1 動物 40 只健康雄性C57BL／6 小鼠，體質(zhì)量（18±2）g，SPF 級，8 周齡，購于上海斯萊克公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2017-0002。

1.2 藥物 大承氣湯由生大黃（600 g）、芒硝（300 g）、枳實(shí)（600 g）、厚樸（1 200 g）組成，以上藥材均購于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院崔波老師鑒定為正品，并經(jīng)甲醇超聲提取60 min，其具體制作方法同Pan 等［9］報道，獲得大承氣湯固體顆粒246 g（得率9.11%），最終用生理鹽水分別配置成0.25、0.5、1 g／mL。

1.3 試劑 雨蛙素（批號SLBS3844）、脂多糖（批號L-2800）購自美國Sigma 公司；所有ELISA 試劑盒，包括淀粉酶（批號ab36345）、TNF-α（批號ab35884）、ALT（批號E4324）、AST（批號E4320）均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；RIPA 裂解液（中）（批號P0013C）、PMSF（批號ST506）、蛋白酶抑制劑（批號P1031）、磷酸酶抑制劑（批號P1082）均購上海碧云天生物科技有限公司；所有抗體，包括RIP1（批號ab42125）、RIP3（批號ab56164）、TNF-α（批號ab6671）、MCP1（批號ab9669）、GAPDH（批號ab181602）抗體均購自英國Abcam 公司。

1.4 儀器 酶標(biāo)儀、雙向電泳儀、PCR 基因擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad 公司）；石蠟組織塊包埋機(jī)、病理切片機(jī)（德國Leica 公司）；Real time PCR 擴(kuò)增儀（美國 Applied Biosystems 公司）；WB 顯影儀（上海培清科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及大承氣湯組低、中、高劑量（5、10、20 g／kg），每組8只（劑量使用按小鼠體表面積劑量換算法獲得）。各組小鼠造模前12 h 及造模后予以禁食（自由飲水），正常組腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.1 mL／10 g，共6 次（間隔時間1 h）；模型組腹腔連續(xù)6 次注射雨蛙素（50 μg／kg），最后2 次聯(lián)合注射脂多糖（7.5 mg／kg），具體方法同Chen 等［10］報道；大承氣湯組在模型組的基礎(chǔ)上，于造模前30 min 及造模后3、6 h 用不同劑量大承氣湯灌胃3 次，給藥體積為20 mL／kg，并于造模后10 h 采集樣本。

2.2 血清炎癥因子檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠摘除眼球取血，并迅速處死，分離上層血清后根據(jù)ELISA Kit 說明書，分別檢測淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 水平。

2.3 胰腺、肝臟組織病理變化觀察 取各組小鼠胰腺、肝臟組織，通過10%中性甲醛固定，梯度脫水后用二甲苯透明，用石蠟包埋，進(jìn)行切片（厚度5 μm），然后HE 染色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺及肝組織病理變化，分別根據(jù)其病變程度（水腫、炎癥及壞死等）進(jìn)行評分，具體病理評分標(biāo)準(zhǔn)分別參考Schmidt［11］、Camargo［12］報道。

2.4 肝組織RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白及mRNA 表達(dá)檢測 剪取適量小鼠肝組織，分別提取總蛋白及RNA，BCA 蛋白定量、RNA 濃度檢測后，根據(jù)相應(yīng)試劑盒操作說明進(jìn)行Western blot 和RT-PCR 法以檢測相應(yīng)蛋白和基因表達(dá)情況。引物由Sangon Biotech 公司合成，序列見表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 大承氣湯對血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 的影響 由表2 可知，模型組小鼠血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 水平較正常組升高（P＜0.01），血清指標(biāo)表現(xiàn)出SAP合并肝損傷模型；在低、中、高大承氣湯組中，這些指標(biāo)均有一定的好轉(zhuǎn)（P＜0.01），并且在高劑量效果最明顯。

通過教師課程統(tǒng)計、日語課程內(nèi)容分析、課程消費(fèi)投入三個表格和數(shù)據(jù)分析可以看出語言方面的課程最受歡迎，包括語音語法能力考等等。在這一部分力求從授課老師與課程內(nèi)容兩個角度來進(jìn)行分析。

表2 大承氣湯對血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 水平的影響（±s，n＝8）

表2 大承氣湯對血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 水平的影響（±s，n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.2 大承氣湯對SAP 小鼠胰腺及肝臟病理的影響 由圖1、表3 可知，正常組小鼠胰腺、肝組織葉間隙分布均勻，無水腫及炎性滲出；模型組小鼠胰腺及肝組織葉間隙擴(kuò)張，小葉內(nèi)彌散炎性細(xì)胞，病理評分均高于正常組（P＜0.01）；大承氣湯組小鼠可不同程度減輕胰腺和肝臟的病理損傷（P＜0.01），并且在高劑量下效果最明顯。

圖1 各組小鼠胰腺及肝臟HE 染色（×200）

表3 各組小鼠胰腺及肝臟病理評分（±s，n＝8）

表3 各組小鼠胰腺及肝臟病理評分（±s，n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.3 大承氣湯對肝臟RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表達(dá)的影響 由圖2、表4 可知，與正常組比較，模型組RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，大承氣湯各組可降低肝臟RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表達(dá)（P＜0.01），且劑量越高效果越明顯，而RIP1 蛋白表達(dá)未見差異（P＞0.05）。

圖2 各組肝臟RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表達(dá)

表4 大承氣湯對RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝8）

表4 大承氣湯對RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.4 大承氣湯對肝臟RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 mRNA表達(dá)的影響 表5 顯示，與正常組比較，模型組RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，大承氣湯組RIP3、TNF-α、MCP1 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），且劑量越高效果越明顯，而RIP1 mRNA 表達(dá)未見差異（P＞0.05）。

表5 大承氣湯對RIP1、 RIP3、 TNF?α、 MCP1 mRNA 的影響（±s，n＝8）

表5 大承氣湯對RIP1、 RIP3、 TNF?α、 MCP1 mRNA 的影響（±s，n＝8）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

4 討論

因胰腺與肝臟的解剖位置毗鄰，SAP 發(fā)生時胰腺所產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)可以通過門靜脈直接損傷肝細(xì)胞，繼而肝臟產(chǎn)生更多的炎癥因子參與到SAP 相關(guān)的局部和全身炎癥反應(yīng)中，使得肝損傷成為AP 發(fā)展為SAP 及死亡的重要因素［13］。研究表明［13-14］，在SAP 早期階段，肝臟可以因刺激而產(chǎn)生TNF-α，而TNF-α 作為促進(jìn)細(xì)胞死亡的主要炎癥介質(zhì)，在不同的模型中可以分別啟動RIP1 調(diào)控的細(xì)胞凋亡或RIP3 調(diào)控的細(xì)胞程序性壞死。研究也表明［14-15］，程序性壞死對AP 的輕重程度有重要影響，在雨蛙素誘導(dǎo)的AP模型中，RIP3 基因過表達(dá)往往引起胰腺腺泡細(xì)胞壞死，并且RIP3 基因的缺失可以降低AP 的嚴(yán)重程度，而RIP1 作為介導(dǎo)凋亡、壞死必須參與的基因，往往在輕癥AP 中高表達(dá)，在SAP 中表達(dá)降低。

近年來研究表明［16-17］，程序性壞死在肝損傷模型中也發(fā)揮著一定的作用，正常肝臟組織表達(dá)RIP1 與RIP3 極低，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道的相一致，并且在不同的模型中RIP1 與RIP3 對肝損傷的作用不同。M Deutsch 研究發(fā)現(xiàn)［4］，在不同的肝損傷模型中，阻斷RIP3 均可一定程度的減輕肝損傷，而RIP1 的阻斷則會加重肝損傷；Wei S等［5］報道RIP3 缺陷可通過ROCK1 調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB 信號通路，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞炎癥減少，以此減輕肝損傷。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)程序性壞死關(guān)鍵基因RIP3 在雨蛙素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的SAP 并發(fā)肝損傷小鼠發(fā)病機(jī)制中有著重要作用，其機(jī)制可能是TNF-α 啟動的RIP3-MCP1 炎癥信號通路，進(jìn)而引起ALT、AST 等促炎因子介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，引起一系列炎癥反應(yīng)，這也提示藥物若能在早期干預(yù)，可通過有效阻止RIP3-MCP1 信號通路激活來避免或減輕SAP 合并的肝損傷。

另外，值得注意的是，雖然有研究顯示大黃可引起一定的肝損傷［19］，但也有學(xué)者基于代謝組學(xué)［20］，發(fā)現(xiàn)在肝纖維化大鼠模型中，大黃又能減少ALT 及AST 含量，表明了大黃對于肝功能的雙向調(diào)節(jié)作用［21］。

本研究顯示，在SAP 合并肝損傷模型中，RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1 基因顯著上調(diào)，而大承氣湯能通過抑制肝臟RIP3、TNF-α、MCP1 蛋白及mRNA 表達(dá)，下調(diào)血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST 水平，其機(jī)制可能是通過調(diào)控RIP3-MCP1 信號通路進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子分泌，最終減輕SAP 小鼠模型的肝損傷程度。但大承氣湯成分繁雜，其在不同模型中對SAP 并發(fā)肝損傷的作用靶點(diǎn)也可能會有不同，并且RIP3-MCP1 信號通路在臨床中的作用也仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，所以大承氣湯在治療SAP 合并肝損傷中的研究仍有待深入探索。