張 霞，李建寬，曹玲亞，高建平

（山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 晉中 030600）

黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川黨參Codonopsis tangshenOliv.的干燥根，具有補中益氣、健脾益肺的功效［1］。目前，市場上流通的黨參主要有山西長治的潞黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.，甘肅的紋黨參Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen、白條黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.，湖北恩施的板橋黨參Codonopsis tangshenOliv.。黨參中所含化學(xué)成分主要有多糖類、黨參炔苷類、黨參苷類、生物堿類、三萜類［2］，多糖是有效成分之一［3］。不同黨參屬多糖的比較對于黨參質(zhì)量控制非常重要［4］。近年來，從中分離獲得了多種分子大小、結(jié)構(gòu)、單糖組成不同的多糖［5-10］。課題組前期對潞黨參多糖研究發(fā)現(xiàn)，它含有菊粉型結(jié)構(gòu)的果聚糖，并具有抗胃潰瘍和促雙歧桿菌增殖活性［11-12］；Fu 等［13］也從素花黨參中分離獲得了一個菊粉型果聚糖。基于黨參中富含大量果聚糖類多糖，本實驗采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）結(jié)合高效液相色譜（HPLC）對不同基源、產(chǎn)地黨參總多糖中低分子量果聚糖進行分析，以期為該藥材開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料

ACS-6 型電子計價秤（永康市盛意電子科技有限公司）；KDM 調(diào)溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DZF-6020 真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；BS124S 電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；KQ5200E 數(shù)顯超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（南京實驗儀器廠）；安捷倫1260 高效液相系統(tǒng)（美國安捷倫公司）。

95%醫(yī)用乙醇（新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司）；無水乙醇、石油醚、甲醇（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；丙酮為國產(chǎn)分析純。不同分子量右旋糖酐對照品（中國食品藥品檢定研究 院，批號 140637-201203～ 140646-201203）；木糖（北京索萊寶科技有限公司，批號409C021，質(zhì)量分數(shù)≥98%）；無水葡萄糖（北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司，批號170724，質(zhì)量分數(shù)≥99%）；果糖（美國Sigma-Aldrich 公司，批號SLBQ0969V，質(zhì)量分數(shù)≥99%）。

潞黨參購自山西省平順縣佛堂嶺，白條黨參購自甘肅省定西市渭源縣清源鎮(zhèn)紅峴村，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高建平教授鑒定為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根；紋黨參購自甘肅省定西市文縣堡子壩方中嶺山村，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高建平教授鑒定為桔?？浦参锼鼗h參Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 的干燥根；板橋黨參購自湖北省恩施市土家族苗族自治州板橋鎮(zhèn)，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高建平教授鑒定為桔?？浦参锎h參Codonopsis tangshenOliv.的干燥根。潞黨參（20170604）、紋黨參（20180312）、白條黨參（20170704）、板橋黨參（20181208）標(biāo)本保存于山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室。

2 方法

2.1 多糖提取 參照文獻［14-15］。分別取潞黨參、紋黨參、白條黨參、板橋黨參藥材各3 份，每份1 kg，切段，室溫下分別加3 L 蒸餾水，浸泡過夜，在微沸狀態(tài)下提取2 h，濾過，收集濾液，藥渣加2.5 L 蒸餾水，微沸下提取1 h，收集濾液，藥渣加2.0 L 蒸餾水，微沸下提取1 h，收集濾液，合并3 次濾液，離心（4 000 r／min）15 min，得多糖溶液5.6 L，旋蒸濃縮至1／4 體積，加95%乙醇使醇沉濃度為80%，4 ℃靜置過夜，抽濾，沉淀用無水乙醇、丙酮、石油醚各洗3 次，分別平均得到潞黨參總多糖165.00 g、紋黨參總多糖62.60 g、白條黨總多糖35.72 g、板橋黨總多糖127.39 g。

2.2 分子量分布測定 采用HPGPC 對多糖的分子量分布進行研究［11，16-17］。色譜條件為安捷倫1260 高效液相配示差折光檢測器；TSKgel G4000PWXL分析柱；檢測器溫度35 ℃；柱溫35 ℃；室溫25 ℃；樣品質(zhì)量濃度1 mg／mL；體積流量0.3 mL／min；流動相超純水進樣量20 μL。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取不同分子量（2 700、5 250、9 750、13 050、36 800、64 650、135 350、300 600）的右旋糖酐對照品，用蒸餾水配制成1 mg／mL對照品溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，記錄各對照品的保留時間。待分析結(jié)束后，以各標(biāo)準(zhǔn)糖的重均分子量（MW）的對數(shù)值為縱坐標(biāo)（lgMW），保留時間為橫坐標(biāo)（tR）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 右旋糖酐對照品分子量及保留時間Tab.1 Molecular weights and retention time of dextran reference substance

2.2.2 樣品測定 將潞黨參、紋黨參、白條黨參、板橋黨參總多糖用蒸餾水各配制成1 mg／mL 溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣20 μL，分別記錄各樣品的圖譜及保留時間，結(jié)果見圖1。根據(jù)保留時間和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算相對應(yīng)的分子量分布。

2.3 單糖組成測定 用HPLC 法直接對多糖水解之后的單糖進行測定［18-20］。色譜條件為安捷倫1260 HPLC 系統(tǒng)-RID 檢測器；ZORBAX NH2分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（85∶15）；體積流量1.0 mL／min；示差檢測器溫度35 ℃；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。

精密稱定果糖和葡萄糖，配制成1 mg／mL 溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，結(jié)果見圖2。多糖中單糖組成的測定需要先將多糖水解為單糖，具體方法為精密稱定潞黨參、紋黨參、白條黨、板橋黨總多糖各10 mg，置于具塞試管中，加入2 mL 2 mol／L三氟乙酸，密封后，100 ℃水解1 h［21-23］。取出水解液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50 ℃下旋干，加入20 mL 甲醇，再次旋干，重復(fù)3 次，殘渣用流動相溶解，過0.45 μm 微孔濾膜，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，結(jié)果見圖3。

圖1 各樣品總多糖HPGPC 圖Fig.1 HPGPC chromatograms of various samples

3 結(jié)果

糖即為果聚糖［11-12］。圖1、表2 顯示，潞黨參中3.78×103、1.59×103Da 果聚糖峰面積沒有顯著差異；紋黨參和白條黨參中3.78×103、1.59×103Da果聚糖峰面積有顯著性差異，且1.59×103Da 高于3.78×103Da；板橋黨參中3.78×103、1.59×103Da果聚糖峰面積有顯著性差異，且3.78×103Da 高于1.59×103Da。由此可知，不同產(chǎn)地對黨參中3.78×103、1.59×103Da 果聚糖含有量有一定影響，而不同基源對其影響不大。

表1 顯示，不同分子量右旋糖酐對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為lgMW＝－0.187 9tR＋9.778 8（R2＝0.992 1）。

圖1 表明，潞黨參、紋黨參、白條黨參、板橋黨參總多糖的分子量分布均在16.000～22.000、33.000、35.000 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其分子量分布為4.41×105～5.92×106、3.78×103、1.59×103Da，主要多糖分布為低分子量 3.78×103、1.59×103Da，課題組前期研究表明此分布區(qū)的多

表2 果聚糖峰面積統(tǒng)計分析Tab.2 Statistical analysis of the peak areas of fructans

表2～3 顯示，潞黨參、紋黨參、白條黨參、板橋黨參總多糖經(jīng)TFA 水解后，其水解產(chǎn)物主要為果糖和葡萄糖，證實其3.78×103、1.59×103Da分子量多糖主要為果聚糖。

表3 各樣品分子量分布及主要單糖Tab.3 Molecular weights distributions and main monosaccharides of various samples

4 討論

結(jié)果表明，潞黨參、紋黨參、白條黨參、板橋黨參總多糖在分子量分布范圍、單糖組成上基本一致，但在3.78×103、1.59×103Da 多糖含有量分布方面具有顯著性差異，并與產(chǎn)地有一定關(guān)系，而與基源無關(guān)。因此，本研究建立的HPGPC 結(jié)合HPLC 方法可用于不同產(chǎn)地黨參的鑒別。