吳 漢，敖梅英，陳雪麗，陳 來，左愛仁，謝燕飛，鄧可眾

（江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，江西 南昌 330004）

細(xì)菌性陰道?。╞acterial vaginosis，BV）是陰道內(nèi)正常菌群失調(diào)所致的一種混合感染，具有發(fā)病率高［1］、易復(fù)發(fā)［2］、危害大［3］等特點。陰道微生態(tài)正常情況下以各種乳酸桿菌為主，它們可以大量產(chǎn)酸、產(chǎn)過氧化氫氣體，維持陰道酸性環(huán)境，抑制有害細(xì)菌的生長。BV 患者體內(nèi)以陰道加德納菌（Gardnerella vaginalis，GV）為首的厭氧致病菌通過黏附陰道上皮細(xì)胞、產(chǎn)生致密生物膜，分泌細(xì)胞毒素等作用使乳酸桿菌不能正常生長而大量死亡，最終造成陰道微生態(tài)菌群環(huán)境紊亂［4］。臨床上常用藥物為甲硝唑、替硝唑、克林霉素等，雖然治愈率理想，但復(fù)發(fā)率高，易耐藥［5］，不適合孕婦等特殊人群［6］。大量文獻(xiàn)報道，傳統(tǒng)中藥復(fù)方，如龍膽瀉肝湯［7-12］、完帶湯［13-14］、治帶方［15］等在BV治療及預(yù)防復(fù)發(fā)中具有確切療效，但相關(guān)作用機(jī)制并不明確。龍膽瀉肝湯是中醫(yī)治療濕熱帶下的經(jīng)典方，上可瀉肝膽之火，下可清利濕熱，除口服外還可用藥渣作用于局部，以起到燥濕殺蟲之功效。本實驗旨在研究龍膽瀉肝湯對GV 的體外抑制作用，為該方臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 按照《醫(yī)方集解》原方比例從北京同仁堂藥店購買龍膽瀉肝湯方劑原料藥；哥倫比亞血瓊脂平板（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號171108）；BHI 肉湯培養(yǎng)基（英國Oxoid 公司，批號12276545）；革蘭氏染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號20150414）；DMEM 培養(yǎng)基（美國HyClone 公司，批號AC10206284）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號1743263）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，批號20170315）；MTT（上海鋪鎮(zhèn)生物有限公司，批號298-93-1）；TRIzol（美國Ambion 公司，批號3596026）；qRTPCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，批號AK4901］；SYBRII 熒光定量試劑［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，批號AHX1020N］。

1.2 細(xì)菌與細(xì)胞 GV 為標(biāo)準(zhǔn)株ATCC14018，購于上海北諾生物有限公司。陰道卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus，LC）由南昌大學(xué)魏華教授饋贈，分離于健康女性陰道分泌物，經(jīng)API 細(xì)菌學(xué)鑒定；Hela 細(xì)胞為本實驗室保存。

1.3 儀器 MarkII 厭氧工作站（荷蘭Mark 公司）；DM2500 普通光學(xué)倒置顯微鏡（德國徠卡公司）；Thermo 3001 多功能全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific）；Thermo 3110 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific）；Light Cycler96 熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）；RE601 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅馬拓科技貿(mào)易有限公司）；SW-CJ-2D 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 龍膽瀉肝湯各部位的制備 龍膽瀉肝湯水提物：按方稱取組成藥材，6 倍量水浸泡6 h，大火煮沸0.5 h 后小火煎0.5 h，濾過，重復(fù)2 次，合并濾液，離心后收集上清液，減壓干燥至恒重。龍膽瀉肝湯70%（95%）醇提物：按方稱取組成藥材，6 倍量70%（95%）乙醇浸泡6 h，70%（95%）乙醇回流提取3 次，濾過，合并濾液，離心后收集上清液，減壓干燥至恒重。

2.2 稀釋法測定龍膽瀉肝湯各部位對GV 的最低抑菌濃度 按2 倍稀釋法，用BHIs 培養(yǎng)基（稱取BHI 固體培養(yǎng)基3.7 g，加入100 mL 去離子水，120 ℃高壓滅菌，臨用前加入10% 胎牛血清、1 mg／L兩性霉素B）配制龍膽瀉肝湯各部位提取物，初始濃度為500 mg／mL（生藥），藥物質(zhì)量濃度從高到低（500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.907、0 mg／mL）設(shè)置。每管加入BHIs 培養(yǎng)基、GV／LC（接種量約為1×104CFU／mL）和不同濃度藥物。培養(yǎng)管在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)48 h后，各取200 μL 加入96 孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀測OD600，每組樣品均設(shè)置2 個復(fù)管。為了去除培養(yǎng)基和藥物顏色對菌體吸光值檢測的干擾，給藥組數(shù)值均減去了培養(yǎng)基和各濃度下藥物的吸光值（藥物濃度越高，其自身吸光值也越高）。

2.3 革蘭氏染色法觀察藥物對GV 黏附人宮頸癌Hela 細(xì)胞的影響 將滅菌的細(xì)胞爬片放置于細(xì)胞培養(yǎng)的6 孔板中，按每孔8×105個數(shù)量接種Hela細(xì)胞，用DMEM 完全培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清）培養(yǎng)過夜。根據(jù)抑菌實驗的結(jié)果，選用的藥物為龍膽瀉肝湯70%乙醇提物。從凍存管中復(fù)蘇GV，按1%的比例接種于5 mL 培養(yǎng)管中，設(shè)置3 組，分別為BHIs 組、BHIs ＋1.56 mg／mL 藥物組、BHIs ＋15.6 mg／mL 藥物組，37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)48 h，8 000 r／min 離心5 min，用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋各組GV，以MOI（菌／細(xì)胞）＝10 的比例加到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)4 h，PBS 洗滌3 次，將未黏附的菌體清洗干凈，4% 多聚甲醛固定10 min，按照革蘭氏染色試劑盒步驟進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察。細(xì)胞黏附于細(xì)胞表面的黏附率評分：未黏附，－；黏附1%～25%，＋；黏附25%～50%，＋＋；黏附＞50%，＋＋＋。

2.4 MTT 法檢測藥物對GV 細(xì)胞毒性的影響 取GV 凍存管，以1% 接種量轉(zhuǎn)接至2 只5 mL 培養(yǎng)管，37 ℃、5% CO2下分別用BHIs 培養(yǎng)基和含藥（15.6 mg／mL 龍膽瀉肝湯70%醇提物）BHIs 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后，8 000 r／min 離心5 min，用DMEM完全培養(yǎng)基將菌體混懸至相同濃度（1×106CFU／mL）備用。取細(xì)胞培養(yǎng)用96 孔板，按每孔1×104個數(shù)量接種Hela 細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。將上述BHIs 培養(yǎng)基和含藥BHIs 培養(yǎng)基培養(yǎng)的GV 分別按照MOI＝1 和MOI＝10 的比例加到Hela 細(xì)胞中，分別培養(yǎng)1、2、3、4 h 后PBS 洗滌2 次，吸去上清，每孔加入100 μL 1%MTT，37 ℃、5%CO2下放置4 h 后，每孔加入分析純DMSO 100 μL，酶標(biāo)儀測OD490，每個樣品設(shè)置有5 個復(fù)孔。

2.5 96 孔微量板法檢測藥物對GV 生物膜形成能力的影響 96 孔微量板法檢測細(xì)菌的生物膜形成能力是被廣泛應(yīng)用的一種方法［16-17］，細(xì)菌形成生物膜以后，與含有明膠的培養(yǎng)板結(jié)合緊密，不易被沖洗掉，結(jié)晶紫染色后可呈現(xiàn)更深的著色。取細(xì)胞培養(yǎng)用96 孔板，每孔加入100 μL 0.1% 明膠，37 ℃放置4 h，小心吸去上清，備用。分別用BHIs 培養(yǎng)基、含藥（1.56、15.6 mg／mL龍膽瀉肝湯70%醇提物）BHIs 培養(yǎng)基配制GV 懸液，終濃度為1×107CFU／mL。將上述GV 按0.2 mL／孔接入明膠包被的96 孔板中，每個樣品設(shè)置4 個復(fù)孔，37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)60 h 后PBS 洗滌3 次，置于無菌超凈臺中吹干，每孔加入100 μL 甲醇固定30 min，棄去甲醇后每孔加入1%結(jié)晶紫，染色生物膜5 min，將96 孔板置于水龍頭下均勻沖洗，晾干后每孔加入200 μL 33%冰醋酸，全波長酶標(biāo)儀測定OD590。

2.6 熒光定量PCR 檢測藥物對GV 中生物膜相關(guān)蛋白（biofilm associated protein，BAP）和唾液酸酶（sialidase）基因表達(dá)的影響 BAP 是一種巨大的細(xì)胞壁錨定黏附素，可同時介導(dǎo)與宿主細(xì)胞的黏附及細(xì)胞間黏附，對生物膜的形成起著重要作用［18］。sialidase 是GV 分泌的細(xì)胞毒性物質(zhì)之一，能降解陰道粘液，直接損傷陰道上皮細(xì)胞。

設(shè)置對照組（GV ＋BHIs 培養(yǎng)基）、BHIs ＋1.56 mg／mL藥物組（GV＋BHIs 培養(yǎng)基＋1.56 mg／mL 龍膽瀉肝 湯70% 醇提物）、BHIs ＋1.56 mg／mL 藥物組（GV ＋ BHIs 培養(yǎng)基＋15.6 mg／mL龍膽瀉肝湯70%醇提物）。將過夜生長的GV 按1∶20 比例接種于5 mL 上述培養(yǎng)液中，厭氧環(huán)境下37 ℃靜置培養(yǎng)24 h 后，用PBS 洗滌2次，轉(zhuǎn)移到500 μL TRIzol 裂解液中。按照TRIzol裂解液說明書提取純化各組菌體總RNA，并溶于含30 μL RNase-free 的水中，用Nanodrop one 對RNA溶液進(jìn)行定量分析。吸取1 μg RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按1∶100 比例稀釋后取2 μL cDNA 溶液作為模板，利用試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTM）進(jìn)行熒光定量PCR。內(nèi)參為菌體16sDNA 片段，對應(yīng)的上下游引物分別為Gv16sc正向5′-AGGTACACTCACCCGAAAGC-3′，反向5′-CACATTGGGACTGAGATACGG-3′；BAP正向5′-GTGTCATTGAGCACACTTGC-3′，反向5′-GTTGTTAAAGAACACATCGAAG-3′；sialidase正向 5′-AGTCGCACTCCGCGCAAGTC-3′，反向5′-GACGACGGCGAATGGCACGA-3′，反應(yīng)在Lightcycle96 儀上進(jìn)行。采用2－ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

3 結(jié)果

3.1 龍膽瀉肝湯各部位對GV 的抑制作用 龍膽瀉肝湯水提物、70%醇提物、95%醇提物對GV 的最低抑菌質(zhì)量濃度分別為（62.5±3.6）、（15.6±1.5）、（125.0±2.8）mg／mL，而龍膽瀉肝湯70%醇提物對陰道內(nèi)LC 最低抑菌質(zhì)量濃度為（62.5±1.6）mg／mL，遠(yuǎn)高于GV，見圖1，說明它對GV的抑菌作用具有選擇性。因此，后續(xù)實驗選擇龍膽瀉肝湯70%醇提物、GV 進(jìn)行實驗。

3.2 龍膽瀉肝湯70%醇提物對GV 黏附人宮頸癌Hela 細(xì)胞的影響 經(jīng)龍膽瀉肝湯70% 醇提物（1.56、15.6 mg／mL）共培養(yǎng)的GV 對Hela 細(xì)胞的黏附減少，見圖2、表1，說明它能抑制GV 的細(xì)胞黏附能力，從而對細(xì)菌性陰道病起到積極的治療作用。

3.3 龍膽瀉肝湯70%醇提物對GV 細(xì)胞毒性的影響 GV 對Hela 細(xì)胞有較強的細(xì)胞毒性，與作用時間和MOI 值相關(guān)。隨著GV 濃度增加，作用于Hela 細(xì)胞的時間延長，細(xì)胞毒性也增強。15.6 mg／mL龍膽瀉肝湯70%醇提物共培養(yǎng)GV 后，Hela 細(xì)胞毒性減弱；MOI＝10 時與BHIs 組比較，15.6 mg／mL 龍膽瀉肝湯70%醇提物作用4 h 后細(xì)胞存活率增加（P＜0.05）。見圖3。

圖1 龍膽瀉肝湯不同提取部位對GV 和LC 的抑菌作用Fig.1 Bacteriostatic effects of different extractions of LXD on GV and LC

圖2 龍膽瀉肝湯70%醇提物對GV 黏附Hela 細(xì)胞的影響（×100）Fig.2 Effects of 70% ethanol extract of LXD on adhesion of GV bacteria on Hela cells（×100）

表1 龍膽瀉肝湯70%醇提物處理后GV 對Hela 細(xì)胞黏附的評分Tab.1 Score for adhesion of GV treated with 70% ethanol extract of LXD on Hela cells

3.4 龍膽瀉肝湯70%醇提物對GV 生物膜形成的影響 與BHIs 組比較，龍膽瀉肝湯70% 醇提物（1.56、15.6 mg／mL）能抑制GV 生物膜形成（P＜0.01）。見圖4。

3.5 龍膽瀉肝湯70%醇提物對GVBAP、sialidasemRNA 的影響 與BHIs 組比較，龍膽瀉肝湯70%醇提物（1.56、15.6 mg／mL）能降低GVBAP、sialidasemRNA 表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5。

圖3 龍膽瀉肝湯70%醇提物對GV 細(xì)胞毒性的影響Fig.3 Effects of 70% ethanol extract of LXD on cytotoxicity of GV

圖4 龍膽瀉肝湯70%醇提物對GV 生物膜形成的影響Fig.4 Effects of 70% alcohol extract of LXD on biofilm formation of GV bacteria

4 討論

龍膽瀉肝湯是中醫(yī)治療濕熱帶下的經(jīng)典方，本方以清上逆之實火、除下注之濕熱的龍膽草為主，橫沖直撞，蕩邪外出；以清泄并舉的黃芩、梔子為輔，清熱以解百毒，泄火而利三焦；佐以澤瀉、木通、午前子三味引火從小便而出，乃宗《內(nèi)經(jīng)》“在下者引而竭之”之意；當(dāng)歸、地黃養(yǎng)血柔肝，以防苦寒傷肝；柴胡為肝膽疏利之要藥，甘草調(diào)和諸藥。全方配伍臻妙，雖苦寒而不傷胃，祛邪兼收扶正固本，諸藥合用，共奏清熱利濕、扶正祛邪之功效。此方為臨床治療BV 的經(jīng)典有效方劑，得到廣泛應(yīng)用［7-12］，兼有口服和局部熏洗，均有確切的療效，但其有效部位和作用機(jī)制尚不清楚。

圖5 龍膽瀉肝湯70%醇提物對GV BAP、 sialidase mRNA 表達(dá)的影響Fig.5 Effects of 70% ethanol extract of LXD on the expression of BAP and sialidase mRNA in GV

GV 是兼性厭氧、革蘭氏染色陰性、非運動、不定形態(tài)的小棒狀菌，雖然在陰道pH 4～5 之間不生長，但它可以在此環(huán)境下黏附在陰道上皮細(xì)胞表面，形成致密的生物膜。生物膜在細(xì)菌性陰道病的發(fā)病過程中起著重要的作用，它既能夠保護(hù)致病菌在不利環(huán)境下存活［19］，也能夠抑制藥物的滲入，使致病菌逃脫宿主的免疫攻擊［20］，抗生素和宿主免疫都不能完全消除生物膜，這也是導(dǎo)致細(xì)菌性陰道病復(fù)發(fā)的主要因素［21］。此外，GV 還能釋放一些細(xì)胞毒性物質(zhì)，如細(xì)菌素、vaginolysins、唾液酸酶、蛋白酶等［22］，直接損傷陰道上皮細(xì)胞，并引起相關(guān)的病理反應(yīng)。

鑒于臨床上龍膽瀉肝湯局部熏洗對細(xì)菌性陰道病有確切療效，本研究考察了龍膽瀉肝湯在體外如何影響GV 的增殖、黏附、生物膜形成、細(xì)胞毒性，這也是構(gòu)成其致病性的主要四大因素。

結(jié)果表明，龍膽瀉肝湯70%醇提物對GV 具有較好的體外抑菌作用，最低抑菌質(zhì)量濃度為（15.6±1.5）mg／mL，而對陰道卷曲乳桿菌的為（62.5±1.6）mg／mL，說明龍膽瀉肝湯70%醇提物對GV 具有選擇性抑制作用，闡釋了中藥復(fù)方在治療細(xì)菌性陰道病中“扶正祛邪”的作用機(jī)制。此外，龍膽瀉肝湯70% 醇提物能抑制GV 黏附Hela細(xì)胞，從而減少它對陰道上皮細(xì)胞的“占位”，有利于陰道微環(huán)境中乳酸桿菌的定位與繁殖。細(xì)胞毒性實驗表明，當(dāng)MOI＝10 時，GV 能在4 h 內(nèi)使Hela 細(xì)胞死亡率達(dá)到35.2%，而用15.6 mg／mL 龍膽瀉肝湯70% 醇提物共培養(yǎng)后的GV 在同等條件下，Hela 細(xì)胞死亡率降低到19.4%，說明龍膽瀉肝湯70%醇提物能夠有效抑制GV 的細(xì)胞毒性。此外，1.56 mg／mL 龍膽瀉肝湯70%醇提物能抑制GV生物膜的形成，可能是其治療細(xì)菌性陰道病的主要機(jī)制之一。

然后，通過qRT-PCR 法測定了龍膽瀉肝湯70%醇提物對GV 中BAP、salldasemRNA 表達(dá)的影響，其中前者能促進(jìn)GV 生物膜形成，后者可增強GV 細(xì)胞毒性；1.56 mg／mL 龍膽瀉肝湯70% 醇提物能顯著抑制這2 個蛋白的轉(zhuǎn)錄，提示兩者可能是藥物作用的重要靶點。

本研究通過一系列體外實驗闡述了龍膽瀉肝湯70%醇提物抑制GV 的作用效果，為該方治療細(xì)菌性陰道病提供了理論依據(jù)，并尋得了更有效的部位，同時對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。今后，將建立適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ?，在體內(nèi)進(jìn)一步探討龍膽瀉肝湯作用機(jī)制及其對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響，并與體外實驗相互佐證。