張喜武，李秋晗，李永吉，劉美欣，徐坐帝，竇金金

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040）

丁香苦苷為木犀科丁香屬植物紫丁香Syringa oblataLindl.的主要化學(xué)成分，是一種環(huán)烯醚萜類化合物［1-3］，具有抗炎、抑菌、抗病毒、強(qiáng)心、保肝［4-6］等作用。課題組前期發(fā)現(xiàn)，丁香苦苷對(duì)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）具有較好的療效［7-8］，已授權(quán)發(fā)明專利，但由于其體內(nèi)消除速度快、半衰期短等原因，導(dǎo)致療效不理想，停藥后病毒有反彈現(xiàn)象，故尋找合適的載體傳遞系統(tǒng)是解決問題的關(guān)鍵。

固體脂質(zhì)納米粒是以固態(tài)天然或合成類脂作為載體，將藥物包裹于脂質(zhì)核中形成的納米粒給藥系統(tǒng)，其生物相容性好，毒性低，具有延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間、提高藥物靶向性的雙重作用［9-12］。課題組前期采用乳化蒸發(fā)法制備丁香苦苷固體脂質(zhì)納米粒，發(fā)現(xiàn)其T1／2、AUC 明顯高于生理鹽水，顯示該成分經(jīng)納米粒包裹后半衰期明顯延長(zhǎng)，從而起到一定的緩釋作用。為了明確該納米制劑靶向作用，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠尾靜脈注射給藥，通過HPLC 法測(cè)定丁香苦苷含有量，然后研究其組織分布，以期實(shí)現(xiàn)該成分高效精準(zhǔn)地靶向治療HBV。

1 材料

1.1 儀器 Waters 高效液相色譜儀（配置Waters 2996-2695 Empower 色譜工作站）；TGL-16C 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；WH-1 微型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；大龍微量移液器（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）；MP2000 電子天平（上海第二天平儀器廠）；BCD-221B／HC容聲冰箱（海信科龍電器股份有限公司）；BF-2000 氮吹儀（北京八方世紀(jì)科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 丁香苦苷對(duì)照品（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)自制，批號(hào)20170430，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）；丁香苦苷原料藥（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)自制，批號(hào)20170501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%）。單硬脂酸甘油酯（批號(hào)20170324，湖南爾康制藥有限公司）；卵磷脂（批號(hào)20170821，上海愛康精細(xì)化工有限公司）；F68（批號(hào)20171002，上海協(xié)泰化工有限公司）。甲醇為色譜純（美國(guó)Dikma 公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào)SYXK（黑）2017-001。

2 方法與結(jié)果

2.1 丁香苦苷固體脂質(zhì)納米粒制備 采用乳化蒸發(fā)法。取單硬脂酸甘油酯約80 mg、卵磷脂約240 mg、丁香苦苷約10 mg，精密稱定，加到5 mL無水乙醇中，加熱使之完全溶解，作為有機(jī)相；取0.4%F68 溶液10 mL，水浴加熱作為水相。在水浴溫度65 ℃、攪拌速度600 r／min 條件下將有機(jī)相緩慢注入水相中，充分?jǐn)嚢枞榛? h 后揮去乙醇，濃縮至約5 mL，得到半透明液體，迅速分散于5 mL稀釋相中（0～2 ℃）攪拌1.5 h，即得。經(jīng)測(cè)定，其平均粒徑為（180.3±5.31）nm，Zeta 電位為－41.9 mV，PDI 為 0.138±0.013，包封率為（42.35±0.60）%，載藥量為（5.33±0.03）%，具有良好的外觀及穩(wěn)定性。

2.2 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；Shimadzu 預(yù)柱（10 L×4.6 mm）；流動(dòng)相甲醇-水（50∶50）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)221 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.3 組織分布研究

2.3.1 含藥生理鹽水制備 精密稱取7.5 mg 丁香苦苷于25 mL 量瓶中，生理鹽水溶解并定容，即得（0.30 mg／mL）。

2.3.2 凍干粉制備 取丁香苦苷固體脂質(zhì)納米粒溶液4 mL 于安瓿瓶中，加入0.7% 海藻糖，充分溶解后放入冷凍干燥機(jī)中，4 h 內(nèi)降溫至－40 ℃，保持3 h，待機(jī)器達(dá)到真空狀態(tài)時(shí)2 h 內(nèi)升溫至－10 ℃，保持20 h，2 h 內(nèi)升溫至28 ℃，保持2 h，壓塞，出箱，即得。經(jīng)測(cè)定，其 平均粒徑為（192.8±5.69）nm，Zeta 電位為－39.8 mV，PDI為0.150±0.010，包封率為（40.40±0.13）%，載藥量為（5.03±0.4）%，再分散性及穩(wěn)定性良好。

2.3.3 實(shí)驗(yàn)操作 60 只小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組與制劑組，每一時(shí)間點(diǎn)平行設(shè)定6 只，對(duì)照組尾靜脈注射含藥生理鹽水，制劑組尾靜脈注射“2.3.2”薦下凍干粉溶液，劑量均為15 mg／kg。給藥后5、15、30、60、90 min 眼球取血，4 000 r／min 離心10 min，血漿于－20 ℃下保存。然后，斷頸處死小鼠，迅速剖取心、肝、脾、肺、腎，生理鹽水清洗血漬后濾紙吸干，置于－20 ℃下保存待用。

2.4 生物樣品處理

2.4.1 血漿 精密吸取血漿樣品100 μL，置于離心管中，將1 mL 蛋白沉淀劑丙酮加到含血漿樣品的離心管中，渦旋混合1 min 后10 000 r／min 離心5 min，上清液在50 ℃氮?dú)庵写蹈桑?00 μL 甲醇溶解剩余殘?jiān)瑴u旋混合1 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾后置于樣品瓶?jī)?nèi)襯管中，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。

2.4.2 組織 精密稱取各組織質(zhì)量后置于組織勻漿器中，按樣品-生理鹽水1∶2 比例進(jìn)行勻漿，勻漿液吸取100 μL 放到1.5 mL 離心管中，加入1 mL 丙酮作為提取溶劑，渦旋混合1 min 后10 000 r／min離心5 min，上清液在50 ℃氮?dú)庵写蹈桑?00 μL甲醇溶解剩余殘?jiān)?，渦旋混合1 min，0.22 μm微孔濾膜過濾至內(nèi)襯管中，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系制備 精密稱取適量對(duì)照品于量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，得到1 mg／mL 貯備液，保存于4 ℃冰箱中，取0.001、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成0.10、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg／mL，取100 μL 用氮?dú)獯?干，加 入100 μL空白組織勻漿液，渦旋混勻，得到0.10、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg／mL 組織樣品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 丁香苦苷線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of syringopicroside

2.5.2 專屬性試驗(yàn) 制備空白、加藥、給藥后各組織樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL 測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，無雜質(zhì)干擾測(cè)定，方法專屬性良好。

圖1 丁香苦苷HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of syringopicroside

2.5.3 精密度試驗(yàn) 按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備含1.0、40.0、80.0 μg／mL 丁香苦苷的血漿樣品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下每天進(jìn)樣測(cè)定5 次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5 d，每天1 次，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見表2。由表可知，各質(zhì)量濃度下日內(nèi)、日間精密度RSD 均小于10%，符合藥動(dòng)學(xué)研究要求。

2.5.4 提取回收率 按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備3種質(zhì)量濃度血漿樣品溶液各5 份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將所得峰面積與相同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液直接進(jìn)樣后的峰面積相比，作為提取回收率，結(jié)果見表3。

表2 丁香苦苷精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.2 Results of precision tests for syringopicroside（n＝5）

2.5.5 方法回收率 按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備3種質(zhì)量濃度血漿樣品溶液各5 份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將測(cè)定量與加入量進(jìn)行比較以計(jì)算方法回收率，結(jié)果見表4。

表4 丁香苦苷方法回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.4 Results of methodology recovery tests for syringopicroside（n＝5）

2.5.6 組織分布 小鼠尾靜脈注射給藥后不同時(shí)間點(diǎn)各組織中藥物質(zhì)量濃度（公式為CiVi／Gi，其中Ci為勻漿液中藥物質(zhì)量濃度，Vi為各組織勻漿液體積，Gi為各組織質(zhì)量）見圖2，相對(duì)分布率（各組織中藥物質(zhì)量濃度／尾靜脈注射總給藥量×100%），見表5～6，1.5 h 內(nèi)各組織中AUC 見圖3。

圖2 各組織樣品藥物濃度-時(shí)間圖Fig.2 Drug concentration-time diagrams of samples in various tissues

表5 尾靜脈注射含藥生理鹽水后丁香苦苷相對(duì)分布率Tab.5 Relative distribution percentages of syringopicroside after tail intravenous injection of medicated normal saline

表6 尾靜脈注射固體脂質(zhì)納米粒溶液后丁香苦苷相對(duì)分布率Tab.6 Relative distribution percentages of syringopicroside after tail intravenous injection of solid lipid nanoparticles

由圖2 可知，尾靜脈注射固體脂質(zhì)納米粒溶液10、30、50、70、90 min 后肝臟中含藥量分別為（62.42±1.23）、（37.31±1.23）、（16.92±2.19）、（8.36±2.44）、（3.71±0.89）μg／g，是含藥生理鹽水的1.76、2.64、1.82、1.54、3.86 倍。由表5～6 可知，與含藥生理鹽水組比較，雖然丁香苦苷固體脂質(zhì)納米粒組織分布趨勢(shì)無明顯變化，但各組織相對(duì)分布水平有所改變。由圖3 可知，尾靜脈注射給藥后丁香苦苷分布在血漿、心、肺中略有減少，脾、腎中有所增加，肝中明顯升高。

圖3 1.5 h 內(nèi)各組織中AUCFig.3 AUCs in various tissues within 1.5 h

2.6 靶向性評(píng)價(jià) 選擇相對(duì)攝取率和靶向效率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來衡量制劑組織靶向性，公式分別為相對(duì)攝取率＝（AUCi）np／（AUCi）s、靶向效率＝AUC靶向／AUC非靶向，其中i 表示組織，np 表示納米粒，s 表示溶液。相對(duì)攝取率越高，靶向性越好，其大于1 表示納米粒在該組織中具有靶向性；靶向效率越高，選擇性越強(qiáng)，其大于1 表示納米粒對(duì)靶組織更有選擇性。另外，以納米粒與溶液靶向效率的比值為靶向增強(qiáng)倍數(shù)。

表7 顯示，丁香苦苷在肝中的相對(duì)攝取率明顯高于其他組織中，即具有肝靶向性；固體脂質(zhì)納米粒、含藥生理鹽水在肝中的靶向效率均大于1，靶向增強(qiáng)倍數(shù)為1.84，表明前者對(duì)該組織的選擇性強(qiáng)于后者。

3 討論

在測(cè)定各組織中丁香苦苷含有量時(shí)發(fā)現(xiàn)，血漿中靜脈注射丁香苦苷固體脂質(zhì)納米粒溶液、生理鹽水時(shí)初始時(shí)間點(diǎn)濃度差距較大，后者明顯降低。這是由于藥物制成納米粒溶液后具有靶向作用，大部分富集于肝，導(dǎo)致血漿中游離藥物濃度下降。

表7 各組織中丁香苦苷靶向性參數(shù)（n＝5）Tab.7 Targeting parameters for syringopicroside in various tissues（n＝5）

體內(nèi)分布研究結(jié)果表明，相對(duì)攝取率為1.65，表明丁香苦苷固體脂質(zhì)納米粒在肝中有良好的靶向性，能明顯提高該成分肝分布；固體脂質(zhì)納米粒組對(duì)肝臟的靶向性明顯高于生理鹽水組，表明該劑型經(jīng)靜脈注射后能很快聚集于肝，從而達(dá)到肝靶向的目的，并增強(qiáng)藥物選擇性。同時(shí)，丁香苦苷固體脂質(zhì)納米粒在肝中的相對(duì)分布率為55.02%，明顯高于血漿、心、脾、肺、腎中，表明它具有肝富集的趨勢(shì)。

被動(dòng)靶向主要通過巨噬細(xì)胞內(nèi)吞、融合等作用被巨噬細(xì)胞攝取，HBV 屬于嗜肝性病毒，在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制傳代，制成納米制劑后能將藥物靶向于肝細(xì)胞，有望從病灶上根除，從而徹底治愈疾?。?3］。粒徑大小決定靶向制劑靶向臟器的不同位置［14-15］，本實(shí)驗(yàn)所制備的丁香苦苷固體脂質(zhì)納米粒粒徑在200 nm 左右，推測(cè)靶向位置可能在肝組織內(nèi)，而并非是實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞。丁香苦苷抗HBV 效果顯著，但如欲徹底清除后者，則納米靶向制劑粒徑應(yīng)控制在100 nm 以內(nèi)，故降低粒徑或表面修飾探針以制成主動(dòng)靶向制劑是今后研究的重點(diǎn)。