(四川旅游學院食品學院,四川成都 610100)

酒花(HumuluslupulusL.)又稱啤酒花,蕁麻目大麻科草屬多年生草本植物,多用于啤酒釀造,多含有苦味物質以及多酚、鞣質和黃酮等具有較為明顯的生理功能和活性的化合物[1-2]。酒花的添加可以為啤酒帶來芬芳的香味和清爽的苦味,還具有防腐抑菌和穩(wěn)定啤酒泡沫的能力[3-4]。將酒花添加到葡萄酒釀造工藝中,能使葡萄酒的滋味更加豐富[5],同時也能夠滿足對新型風味的葡萄酒的開發(fā)[6]。西楚酒花是一種美國頂端的苦香兼優(yōu)的全能型酒花[7],其香氣特點是為酒體帶來檸檬、荔枝和天竺葵的風味。

香氣是構成和影響葡萄酒內(nèi)在品質以及評價葡萄酒典型性和風格的重要指標[8]。葡萄酒香氣主要與釀造酒液的葡萄、發(fā)酵過程以及陳釀過程有關[9-11]。頂空固相微萃取氣質聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)是一種常見的用于香氣成分確定的手段,已廣泛用于葡萄酒香氣成分的分析[12-14]。目前已檢測到的存在于各類葡萄酒中的香氣化合物有近800余種,不同品種的葡萄酒所含香氣成分種類有所不同[15-17]。

本研究首次將西楚酒花與葡萄酒釀造相結合,釀造出帶有酒花風味的新型葡萄酒,通過采用GC-MS技術對其香氣成分進行定性、定量分析,利用主成分分析(PCA)其中影響香氣成分的關鍵因子,旨在確定其香氣成分特點及風味特征,結合香氣閾值確定不同揮發(fā)性成分的相對氣味活度值(ROAV),探究西楚酒花對玫瑰香葡萄酒香氣的影響,以及不同濃度西楚酒花加入后相互間的香氣差異,以此為新型葡萄酒的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

75 μm CAR/PDMS手動萃取頭 美國Supelco公司;PC-420D專用磁力加熱攪拌裝置、SQ680氣相色譜質譜聯(lián)用儀 美國PerkinElmer;WK2102電磁爐 美的集團有限公司;FALLC4N電子天平 常州市衡正電子儀器有限公司;HHS-8S電子恒溫不銹鋼水浴鍋 上海廣地儀器設備有限公司;MY-50粉碎機 廣州市揚鷹醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒花葡萄酒釀造的工藝流程 葡萄清洗→破碎→放入發(fā)酵瓶→加入酒花溶液→接入酵母→前發(fā)酵→除糟→后發(fā)酵→澄清→過濾→裝瓶

1.2.2 酒花葡萄酒釀造的工藝要點 干酵母活化:稱取一定用量的安琪活性干酵母,將其加入到無菌水中,水浴38～43 ℃活化30 min后冷卻至30 ℃以下,備用。

酒花溶液制作:取200 mL蒸餾水加熱至100 ℃,保持2 min,然后加入酒花,熬制4 min,待酒花溶液充分冷卻后,再進行過濾,備用。配制5種濃度梯度0.0、0.5、0.8、1.0、1.3 g·L-1的酒花溶液,分別標記為C00、E01、E02、E03、E04。

葡萄酒的釀造:選取成熟度高、無霉爛變質及無病蟲害的新鮮玫瑰香葡萄,清洗干凈、去皮取果肉和葡萄籽。將果肉和其重量20%的酒花溶液一起放入發(fā)酵瓶中,接入1.0%活化后的酵母溶液,在25 ℃條件下進行發(fā)酵,待皮渣下沉,整罐酒體變渾濁,酒液基本沒有甜味時,前發(fā)酵結束[18],添加糖調(diào)整酒樣總糖度至22°Brix。過濾除雜后繼續(xù)發(fā)酵(15 ℃、120 h),待后發(fā)酵結束后,低溫(2±2) ℃保藏168 h。在溫度為15 ℃的條件下,向酒液中加入1%殼聚糖溶液,用量為0.05%[18],然后進行澄清,澄清時間為10 h。將澄清過濾后的酒液在5 ℃條件下陳釀3個月,然后置于陰涼通風環(huán)境下進行保藏。

1.2.3 樣品處理 量取葡萄酒4 mL于15 mL裝有磁力攪拌器的頂空瓶中,加入1.0 g NaCl,加蓋密封后放入40 ℃水浴中平衡10 min,將老化好的固相微萃取器插在樣品瓶上吸附40 min后拔出,插入氣相色譜儀進樣口,于230 ℃解吸3 min,進行GC-MS檢測分析。

1.2.4 GC-MS檢測的儀器條件 氣相色譜條件:色譜柱為DB-Wax(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度為230 ℃;升溫程序:初始溫度40 ℃,保持5 min,以6 ℃/min升至230 ℃,保持6 min;載氣為氦氣,流速0.97 mL/min,不分流。

質譜條件:電離方式為電子電離(electron ionization,EI)源,電子能量為70 eV,燈絲流量為0.20 mA,離子源溫度為230 ℃,接口溫度為250 ℃,掃描范圍30.00～500.00 m/z。

2）中水系統(tǒng)缺少轉水過濾裝置。沉淀池過多的懸浮固體通過出水口進入?yún)捬醭?，并逐池流轉，造成厭氧池、好氧池、MBR池的雜質和淤泥累積過快，轉水泵及管線頻繁堵塞，MBR膜絲污染、壽命縮短，影響系統(tǒng)連續(xù)穩(wěn)定運行。

1.2.5 相對氣味活度值(ROAV) 采用相對氣味活度值(ROAV)評價各風味成分對樣品總體風味的貢獻[19],各化合物的ROAV計算公式如下:

其中:Ci、Ti分別為各揮發(fā)性組分的相對含量和嗅覺閾值;Cs tan和Ts tan分別為樣品相對含量最大的組分相對含量和嗅覺閾值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

香氣成分定性分析[20]:未知化合物經(jīng)過計算機與NIST譜庫和Wiley譜庫檢索定性,結合解析譜庫,確定香氣物質。香氣成分定量分析[21]:按峰面積歸一法計算各組分的相對含量。主成分分析:采用SPSS21.0軟件對不同香氣成分種類進行主成分分析。

2 結果與討論

2.1 西楚酒花葡萄酒香氣成分分析

應用GC-MS對不同濃度的西楚酒花葡萄酒進行揮發(fā)性物質檢測和分析,所得總離子流色譜圖如圖1～圖5所示,質譜圖中共分離出42個色譜峰,通過計算機中NIST08譜庫檢索分析,共鑒定出31種揮發(fā)性風味物質。圖1為未添加酒花的玫瑰香葡萄酒(C00),結合計算機NIST譜庫檢索,C00檢測出的主要揮發(fā)性物質共有16種,其中酯類6種、醇類7種、其他類3種,分別占總組分的5.56%、57.28%、6.24%。

圖1 C00酒樣揮發(fā)性風味物質GC-MS總離子圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile flavor compounds in C00 wine

圖2 各酒樣揮發(fā)性風味物質GC-MS總離子圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of volatile flavor compounds

根據(jù)圖2各不同濃度酒花酒樣的總離子圖及計算機NIST譜庫檢索,E01檢測出的主要揮發(fā)性物質共有16種,其中酯類7種、醇類8種、酸類1種,分別占總組分的6.59%、34.31%、0.53%。E02檢測出的主要揮發(fā)性物質共有17種,其中酯類8種、醇類9種,分別占總組分的10.74%、58.16%。E03檢測出的主要揮發(fā)性物質共有20種,其中酯類9種、醇類9種、其他類2種,分別占總組分的13.06%、67.94%、0.29%。E04檢測出的主要揮發(fā)性物質共有15種,其中酯類8種、醇類5種、其他類2種,分別占總組分的12.58%、55.85%、0.64%。

綜合分析可知,醇類和酯類仍是各個酒樣的主體香氣物質,酒花濃度的不同使得西楚酒花葡萄酒檢測出的揮發(fā)性物質總量上存在差異。E02、E03酒樣的揮發(fā)性物質均多于空白對照組,說明一定濃度的西楚酒花在葡萄酒產(chǎn)香過程中起到積極作用而增加葡萄酒揮發(fā)性物質的種類。而E04酒樣檢測出的揮發(fā)性物質種類數(shù)量減少,說明高濃度的西楚酒花可能會減少葡萄酒中的揮發(fā)性物質,其原因可能在于高濃度的西楚酒花使得葡萄酒產(chǎn)生的香氣物質化學性質不穩(wěn)定而無法通過質譜檢測到。

2.2 西楚酒花玫瑰香葡萄酒香氣含量及特征分析

根據(jù)GC-MS分析結果以及查閱相關文獻,對31種香氣物質進行分析,確定每種香氣成分的含量及香味特征,具體如表1所示。

表1 不同濃度西楚酒花玫瑰香葡萄酒風味物質成分Table 1 Flavor components in rose-flavored wines with different concentrations of citra hop

注:所列成分都為檢測圖譜中匹配度>80%的組分。

不同濃度的西楚酒花葡萄酒(E01～E04)中共有29種揮發(fā)性成分,其中相同成分有10種,包括乙酸戊酯、乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、1-戊醇、芳樟醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇。其中除乙酸戊酯外,其他9種物質也同樣出現(xiàn)在空白酒樣中。這9種共有的揮發(fā)性物質主要表現(xiàn)為果香和花香,而西楚酒花的加入整體貢獻為增大其相對含量,提高果香和花香的貢獻度,改善葡萄酒的香氣。

五個酒樣中共檢測出13種酯類,相對含量較多的是乙酸異戊酯、正己酸乙酯、丁二酸二乙酯等,這些酯類大部分呈現(xiàn)出水果香味,可能是葡萄漿果果皮中的酯類或者發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酯類。不同濃度西楚酒花玫瑰香葡萄酒樣的酯類物質在種類和相對含量上都有所差異。如具有水果香的丁二酸二乙酯在添加西楚酒花的各酒樣(E01、E02、E03、E04)中含量相比空白對照組(C00)得到了明顯提高,總體趨勢是隨著酒花濃度的增加,含量隨之增加,乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯同樣如此。但最高濃度西楚酒花的樣品E04在酯類種類數(shù)量上卻相比其他組少,其原因有待于進一步研究。

本次試驗檢測出11種醇類物質,其中1-戊醇、芳樟醇、苯乙醇、香茅醇的相對含量較高。1-戊醇呈現(xiàn)出青草香、芳樟醇具有花香、苯乙醇和香茅醇具玫瑰香。添加西楚酒花的樣品在這幾種醇類(除1-戊醇外)的含量上都相比空白對照C00有所增加,且趨勢表現(xiàn)為隨酒花濃度的增加,相對含量增加越明顯。結合酒花香氣相關研究[22]可知,酒花中重要的香氣物質之一橙花醇在E01、E02、E03中都有檢測出,說明西楚酒花的香氣物質能在葡萄酒中得以保留。貢獻酒花香氣最重要的物質里那醇和香葉醇[23]雖然在西楚酒花葡萄酒中未檢出,但兩者的轉化產(chǎn)物α-松油醇和香茅醇在加入酒花的酒樣中其相對含量明顯增加且香菜醇總體趨勢是隨酒花濃度的增加而增加,其原因可能在于葡萄酒發(fā)酵過程產(chǎn)生的酸和酶使得酒花原有的揮發(fā)性成分發(fā)生化學轉換[24]。在醇的種類上,添加了西楚酒花的樣品檢測出了空白樣品不含有的其他醇類如:E02檢測出正庚醇,E03檢測出的2-甲基-1-丁醇、E01、4,5-辛二醇、2,3-己二醇。根據(jù)酯類及醇類結果推測,西楚酒花的添加有利于葡萄酒釀造過程中呈香物質的產(chǎn)生。

2.3 西楚酒花玫瑰香葡萄酒香氣成分含量的主成分分析

主成分分析法是研究指標體系的內(nèi)在結構,然后利用降維思想把多指標轉換成少數(shù)幾個相互獨立的綜合指標(主成分),減少了信息的交叉,分析評估結果更具有客觀性和準確性[25-26]。根據(jù)香氣定量分析結果,運用SPSS 21.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對31個成分指標進行處理,最終提出4個主成分,由表2可知,前4個主成分的累計貢獻率為100%。其中前3個主成分可以解釋總方差的85.397%,以酒樣在前3個主成分上的得分作圖,結果見圖3。

表2 提取4個主成分的方差解釋Table 2 Analysis of variance of 4 principal components

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Principal component load matrix

表3可知,第1主成分反應的指標主要有草酸二丁酯、4,5-辛二醇、異辛烯、丙酸正丙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇、蒈烯;第2主成分反應的指標主要有2-甲氧基乙醇酯、(+)-玫瑰醚、反式-β-金合歡烯、正己酸乙酯、乙酸異戊酯;第3主成分反應的指標主要有1-戊醇、丙酸異戊酯、4-羥基-2-丁酮、二已二醇丁醚;第4主成分反應的指標主要有3-羥基丁酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基-1-丁醇、正庚醇、α-松油醇。整體葡萄酒樣品的香氣構成主要仍是以酯類和醇類為主,這與李凱等[27]研究中保持一致,說明酒花加入后并沒有改變葡萄酒的整體香氣結構,酒花對葡萄酒香氣的影響并不是簡單疊加作用。

在圖3(a)中,得分圖上的位置顯示樣本的分類信息。5個酒樣呈分散分布說明添加西楚酒花的玫瑰香葡萄酒與空白組產(chǎn)生的香氣成分之間差異明顯,且不同濃度之間也存在差異,可通過香氣成分的主成分分析區(qū)別不同濃度的西楚酒花玫瑰香葡萄酒。圖3(b)是以香氣成分在前3個主成分上的載荷作圖結果,結合圖3(a)分析各酒樣與香氣成分的相關性可知,V26、V27、V14與C00相關,因此最能反映C00與添加西楚酒花酒樣香氣成分含量差異的是1-戊醇(V14)、4-羥基-2-丁酮(V26)、二已二醇丁醚(V27)。同理3-羥基丁酸乙酯(V4)、丁酸乙酯(V6)、正庚醇(V17)最能反映E01與其它酒樣差異的香氣成分;2-甲基-1-丁醇(V16)、2,3-己二醇(V24)最能反映E02與其它酒樣差異的香氣成分;2-甲氧基乙醇酯(V7)、反式-β-金合歡烯(V28)、(+)-玫瑰醚(V31)最能反映E03與其它酒樣差異的香氣成分;草酸二丁酯(V2)、橙花醇(V22)、蒈烯(V30)最能反映E04與其它酒樣差異的香氣成分。不同濃度的西楚酒花釀造出的葡萄酒產(chǎn)生的香氣也存在差異,且有各自的特有揮發(fā)性物質,但酒花濃度與這些揮發(fā)性物質的關系還有待進一步研究。

圖3 酒樣在前3個主成分上的分布(a) 及香氣在前3個主成分上的分布(b)Fig.3 Loadings of wine samples(a)and aroma components(b)in the first three PCs

2.4 關鍵風味化合物分析

風味物質在葡萄酒香氣中發(fā)揮作用的大小,既與其相對含量有關也與其嗅覺閾值有關。結合各揮發(fā)性成分的相對含量和嗅覺閾值可知,正己酸乙酯在C00、E01、E03和E04酒樣中的相對含量偏高,嗅覺閾值偏小,因而正己酸乙酯對這四種酒樣風味有重要的貢獻,定義其在四種酒樣中ROAVstan=100;E02中未檢出正己酸乙酯,定義香茅醇在E02酒樣中ROAVstan=100,計算其他化合物的ROAV[28]。當ROAV>1時,該化合物為酒樣的關鍵風味化合物;當0.1≤ROAV<1時,認為該物質對酒樣總體風味具有重要的修飾作用[29]。

表4 西楚酒花玫瑰香葡萄酒揮發(fā)性成分的ROAV值Table 4 ROAV of value volatile components in rose-flavored wines with citra hop

由表4可知,ROAV大于0.1的香氣化合物共有12種,酒樣C00中共有6種關鍵風味化合物,分別為正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、1-戊醇、正己醇、香茅醇;E01中8種關鍵風味化合物,分別為正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、1-戊醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇;E02中9種關鍵風味化合物,分別為丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、1-戊醇、正己醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇;E03中4種關鍵風味化合物,分別為正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇、香茅醇;E04中3種關鍵風味化合物,分別為正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、香茅醇。其中賦予葡萄酒玫瑰香的香茅醇,其ROAV值較大,且空白對照組均低于加入西楚酒花的酒樣,說明西楚酒花的加入在一定程度對玫瑰香葡萄酒的特征風味具有增強作用。而在其他揮發(fā)性化合物ROAV值雖小但在綜合評價酒花對葡萄酒的風味影響時具有助香作用,與其他化合物共同構成其特征風味[30]。

2.5 香氣輪廓分析

采用感官分析來描述各香氣類型的強度,不同濃度西楚酒花玫瑰香葡萄酒的香氣輪廓見圖4。通過感官分析描述了7個香氣類型,所有酒樣中果香和花香的強度最高,但不同酒樣的香氣輪廓存在差異?？瞻讓φ战M(C00)中的果香強度中等,花香強度較弱,同時有略微的化學味、植物與礦物味,整體香氣強度偏低;E01果香和花香強度中等,化學味香氣強度較弱,略有植物與礦物味,整體香氣強度中等;E02果香和花香強度中等,化學味、植物與礦物味香氣較弱,整體香氣強度中等;E03以較強的果香和花香為主,略有化學味、植物與礦物味香氣,整體香氣強度強;E04果香和花香強度偏低,化學味香氣弱,整體香氣強度偏低。結合定量分析結果和ROAV值可以發(fā)現(xiàn),香氣成分百分含量與西楚酒花玫瑰香葡萄酒香氣強度并不成正比,除此,當酒樣的關鍵風味化合物一致時,其香氣特征和強度也不同,原因在于各香氣成分ROAV值不同。

圖4 不同濃度西楚酒花玫瑰香葡萄酒的香氣輪廓Fig.4 Aroma profile of rose-flavored wines with different concentrations of citra hop

3 結論

利用GC-MS對不同濃度西楚酒花對玫瑰香葡萄酒的揮發(fā)性物質的影響。結果表明,共檢測出31種揮發(fā)性物質,包括13種酯類、11種醇類、1種酸類和6種其他化合物,且不同酒樣(C00、E01、E02、E03、E04)總香氣含量存在差異,分別檢測出揮發(fā)性物質占各自總揮發(fā)性物質的68.08%、41.43%、68.90%、81.29%、69.07%。主成分分析表明,4個主成分可以有效解釋全部揮發(fā)性物質的信息,不同濃度西楚酒花對玫瑰香葡萄酒的香氣成分有較大差異,葡萄酒中能保留部分酒花原有香味物質,但整體來看酒花香氣物質與原本葡萄酒香氣物質不是簡單疊加。關鍵風味化合物分析結果表明,空白對照組(C00)中共有6種關鍵風味化合物,包括正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、1-戊醇、正己醇、香茅醇;E01中8種關鍵風味化合物,包括正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯、1-戊醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇;E02中9種關鍵風味化合物,包括丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、1-戊醇、正己醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇;E03中4種關鍵風味化合物,包括正己酸乙酯、丁二酸二乙、苯乙醇、香茅醇;E04中3種關鍵風味化合物,包括正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、香茅醇,酒花濃度導致西楚酒花葡萄酒酒樣特征香氣不同的機理尚待研究。西楚酒花玫瑰香葡萄酒特征香氣形成的重要因素是關鍵香氣成分風味化合物,因為各香氣成分ROAV 值不同,導致最終葡萄酒的香氣輪廓不同,其中酒樣E03中整體香氣強度高,花果香香氣突出,可用于后續(xù)研究。