,*

(1.南寧師范大學(xué)廣西地標(biāo)作物大數(shù)據(jù)工程技術(shù)研究中心,廣西南寧 530001;2.南寧師范大學(xué)北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530001;3.容縣土肥植保經(jīng)作站,廣西容縣 537500)

沙田柚(Citrusgrandisvar.shatinyu)屬蕓香科柑橘屬,原產(chǎn)地為廣西壯族自治區(qū)容縣沙田村,是我國栽培面積最大、產(chǎn)量最高的柚類品種[1]。沙田柚果形碩大,風(fēng)味獨(dú)特清香,一般來說沙田柚果實(shí)在常溫可以儲藏4～6個月[2],是柑橘類中耐存儲的品種,有“天然水果罐頭的美譽(yù)”[3],沙田柚果實(shí)采收后即變?yōu)橐粋€獨(dú)立的代謝系統(tǒng),沙田柚品質(zhì)主要由采收時的品質(zhì)所決定[4]。

根據(jù)前期調(diào)研發(fā)現(xiàn),沙田柚果實(shí)品質(zhì)是沙田柚生產(chǎn)中的限制因素,果實(shí)過大或過小的沙田柚品質(zhì)都不佳。前人研究也發(fā)現(xiàn),較大的沙田柚果實(shí)品質(zhì)并非最佳[5],沙田柚果實(shí)大小和品質(zhì)關(guān)系目前沒有相關(guān)報道。本文以此為切入點(diǎn)對沙田柚果實(shí)大小和品質(zhì)的關(guān)系及其可能機(jī)理進(jìn)行研究,以期對沙田柚果樹采摘前疏花疏果管理、采后果實(shí)分級,進(jìn)而對沙田柚經(jīng)濟(jì)效益的提升有所幫助。

本研究以沙田柚為材料,對采后沙田柚品質(zhì)相關(guān)的性狀(可溶性固形物、沙田柚果皮厚度、種子數(shù)目、果形指數(shù))和沙田柚大小的關(guān)系進(jìn)行研究,同時對同株果樹上、不同大小的沙田柚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,以期對果實(shí)重量影響品質(zhì)的分子機(jī)制進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙田柚 試驗(yàn)基地依托玉林市容縣容州鎮(zhèn)五一柚場(經(jīng)度111.33°,緯度22.55°,最高海拔151米),柚場擁有2000株20～30年生成熟沙田柚果樹,2018年11月,按照柚場方位東、南、西和北坡位,隨機(jī)等量采收套袋的沙田柚,采后運(yùn)回室內(nèi)選擇成熟度較一致、果皮無損傷和無病蟲傷疤的沙田柚果實(shí),試驗(yàn)可用果實(shí)303個。

工業(yè)級電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺 鋼拓公司;數(shù)顯糖度計 FANUOWEI公司;JA2603B電子天平 上海精科天美;HISeq4000測序平臺 美國Illumina;Mastercycler X50h PCR儀器 德國Eppendorf。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 品質(zhì)指標(biāo)測定

1.2.1.1 果實(shí)總重量(全果,帶果皮)的測定 利用電子天平直接測量;沙田柚大小分組參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),果實(shí)質(zhì)量等級劃分為900～1099、1100～1299、≥1300 g 三個等級[6],本研究將其細(xì)化,以50 g差異為分組標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.1.2 可溶性固形物含量測定 取果實(shí)赤道附近果肉囊瓣中部的汁胞,每次取樣30 g,置于紗布榨取汁液,而后利用FANUOWEI數(shù)顯糖度折射儀器測定可溶性固形物(soluble solid content,SSC)含量,每個果實(shí)三次重復(fù)[7]。

1.2.1.3 果皮厚度及果形指數(shù)的測定 利用四分法對稱切割沙田柚,利用游標(biāo)卡尺統(tǒng)一測量四份沙田柚縱徑赤道處果皮厚度,取其均值為果皮厚度。利用游標(biāo)卡尺直接測量果實(shí)的橫縱徑[8],果形指數(shù)=縱徑/橫徑。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序 為對其采后品質(zhì)差異機(jī)理進(jìn)行研究,在同一株沙田柚果樹上選850～900、1150～1200 g沙田柚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,選三株樹作為三次重復(fù)處理。

測序材料前處理:采后沙田柚四分法對稱切割,每份均勻取果肉,裝入50 mL無菌離心管,液氮速凍。

轉(zhuǎn)錄組測序:轉(zhuǎn)錄組測序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成;取RNA 1.5 μg,富集純化后,利用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈,隨后利用DNA聚合酶和RNase H合成cDNA第二鏈,再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA經(jīng)過修復(fù)、A尾接頭后,進(jìn)行片段大小選擇。而后擴(kuò)增、純化,得到最終的文庫。文庫構(gòu)建完成后,把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行Illumina HiSeq測序。

差異表達(dá)基因篩選及富集分析:基因差異表達(dá)的輸入數(shù)據(jù)為基因表達(dá)水平分析中得到的readcount數(shù)據(jù)。本研究的兩個組別有三次生物學(xué)重復(fù),采用DESeq2[9]進(jìn)行分析,篩選閾值為padj<0.05且|log2FoldChange|>1。Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位,應(yīng)用超幾何檢驗(yàn),找出差異基因相對于所有有注釋的基因顯著富集的pathway[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

生理指標(biāo)利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入,利用SPSS 23進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;利用KAAS軟件進(jìn)行KEGG注釋,利用Blast2go軟件進(jìn)行GO注釋,利用DEGSeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙田柚大小與品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

2.1.1 隨機(jī)采摘沙田柚的質(zhì)量分布 本研究中,303個沙田柚果實(shí)質(zhì)量在817.79～1390.17 g之間,按照重量將沙田柚劃分為10組,其中低于900 g和高于1300 g的沙田柚由于數(shù)量相對較少,分為兩組,質(zhì)量在900 g～1300 g之間的沙田柚以50 g差異為區(qū)分,劃分為八組。本研究中,沙田柚的平均質(zhì)量為1094.95 g,對其進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),K-S結(jié)果sig=0.2>0.05,說明本研究中沙田柚質(zhì)量分布符合正態(tài)分布,質(zhì)量主要集中在1000～1150 g這3個組別之間,合計162個沙田柚(圖1)。

圖1 不同大小沙田柚?jǐn)?shù)量分布圖Fig.1 Distribution of different sizes of Shatian pomelo

2.1.2 果實(shí)大小和可溶性固形物之間的關(guān)系 在水果中,可溶性固形物決定了果實(shí)的風(fēng)味和品質(zhì)[11]。調(diào)研發(fā)現(xiàn),在生產(chǎn)實(shí)踐中可溶性固形物含量是沙田柚品質(zhì)評判最直接的指標(biāo)。本研究中,全部沙田柚可溶性固形物含量值在9.53%～14.83%之間。由圖2可知,各個組別之間可溶性固形物含量均值在11.23%～11.94%之間,950～1000 g組別可溶性固形物含量最高,900～950 g的組別最低,可溶性固形物的平均值為11.55%,對其進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn),沙田柚果實(shí)并非越大可溶性固形物含量越高,適中大小的沙田柚具有最高的可溶性固形物含量。

圖2 沙田柚大小與可溶性固形物關(guān)系Fig.2 The relationship between the size of Shatian pomelo and soluble solids content注:數(shù)據(jù)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;不同字母表示 差異顯著(P<0.05);圖3～圖5同。

2.1.3 果實(shí)大小和沙田柚種子數(shù)之間的關(guān)系 對植物本身來說,無核或少核是一個不利的性狀,但對果實(shí)品質(zhì)來說,無核或少核是一個優(yōu)良的性狀,該性狀對沙田柚的鮮食或作為原料進(jìn)行加工有重要意義[12]。沙田柚大小與種子個數(shù)關(guān)系如圖3所示。本研究中,沙田柚發(fā)育完全的種子數(shù)目為4～236,平均值為100.27,不同組別之間沙田柚種子數(shù)目平均值為58.88～119.45,且隨著重量的增大果實(shí)種子數(shù)增加,這說明沙田柚果實(shí)的生長發(fā)育和種子數(shù)目存在密切的關(guān)系。

圖3 沙田柚大小與種子數(shù)關(guān)系Fig.3 The relationship between the size of Shatian pomelo and seed number

2.1.4 果實(shí)大小和沙田柚果皮厚度之間的關(guān)系 沙田柚皮厚增加時,可食率降低[13]。沙田柚大小與沙田柚皮厚度關(guān)系如圖4所示。本研究中,沙田柚果皮厚度值在13.97～24.42 mm之間,不同大小的沙田柚果皮厚度平均值在17.52～20.37 mm,平均果皮厚度為18.12 mm,950～1000 g這一組果皮最薄。隨著沙田柚質(zhì)量的增加,沙田柚果皮厚度增厚。在沙田柚重量1200 g以下時,果皮厚度無顯著變化(P>0.05),沙田柚重量超過1200 g的3組與其他各組之間果皮厚度存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 沙田柚大小與沙田柚皮厚度關(guān)系Fig.4 The relationship between the size of Shatian pomelo and thickness of the peel

2.1.5 果實(shí)大小和沙田柚果形指數(shù)之間的關(guān)系 果形指數(shù)可以體現(xiàn)沙田柚的外觀品質(zhì),外觀品質(zhì)是果實(shí)價值的一部分。沙田柚大小與縱橫徑比值的關(guān)系如圖5所示。本研究中,沙田柚果形指數(shù)在0.94～1.45,果形指數(shù)平均值為1.19,不同大小的沙田柚果形指數(shù)平均值為1.16～1.23,果形指數(shù)隨著沙田柚重量增加波動上升,但各組別之間果形指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。

圖5 沙田柚大小果形指數(shù)的關(guān)系Fig.5 Relationship between the size of Shatian pomelo and fruit-shape index

2.1.6 沙田柚重要指標(biāo)之間的相關(guān)性分析 利用SPSS軟件對沙田柚幾個重要指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如表1所示。由表1可知,沙田柚果實(shí)質(zhì)量和種子數(shù)、縱徑、橫徑、皮厚度四個指標(biāo)極顯著正相關(guān)(P<0.01),這一結(jié)果與前文所述結(jié)果存在一定的對應(yīng)性;種子數(shù)和可溶性固形物含量極顯著正相關(guān)(P<0.01),和皮厚度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),這一現(xiàn)象可能與種子分泌沙田柚內(nèi)源激素對果實(shí)的調(diào)節(jié)有關(guān);可溶性固形物含量除和種子數(shù)極顯著正相關(guān)(P<0.01)外,和果形指數(shù)同樣呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),這為地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品對容縣沙田柚外觀要求為葫蘆形或梨形的合理性提供直接的證據(jù)。

表1 沙田柚重要指標(biāo)相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of important indexes of Shatian pomelo

注:“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

由于全部沙田柚可溶性固形物含量和質(zhì)量沒有相關(guān)性,對其進(jìn)行分段探討發(fā)現(xiàn),1000 g以下,沙田柚可溶性固形物含量和沙田柚質(zhì)量極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)達(dá)0.4566(P<0.01),950～1150 g之間極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.2251(P<0.01)。950～1200 g,質(zhì)量和可溶性固形物含量之間關(guān)系為顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.1464(P<0.05)。超過1200 g的組別,質(zhì)量和可溶性固形物含量之間相關(guān)系數(shù)沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

2.2 不同大小的沙田柚轉(zhuǎn)錄水平的差異

綜合考慮果實(shí)重量和可溶性固形物兩個指標(biāo),由于可溶性固形物含量在質(zhì)量超過1200 g和低于950 g的5個組別之間沒有差異,而可溶性固形物值最高的兩個組別與最低的組別質(zhì)量相鄰,所以選擇850～900 g和1150～1200 g作為小和大兩組沙田柚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,分析不同質(zhì)量沙田柚品質(zhì)差異的可能原因。

2.2.1 測序結(jié)果、質(zhì)量評估、功能注釋及其分類 本研究中,堿基百分比(Q20)含量在97.73%～98.00%,Q30含量在90%以上,即本研究得到的測序質(zhì)量較好。組裝獲得Unigene后對基因功能進(jìn)行注釋,合計注釋 Unigenes數(shù)目為31728,所有的Unigenes都被注釋成功。根據(jù)Nr庫比對上的物種分布圖如圖6,其中85.1%的Unigenes被柑橘屬植物比對成功,分別是橙子、克萊門柚和溫州蜜柑,另外有0.9%被蓖麻和0.7%被擬南芥比對成功。

圖6 Nr庫比對上的物種分布圖Fig.6 Species distribution map by nr library comparison

對基因做KO注釋后,可根據(jù)它們參與的KEGG代謝通路進(jìn)行分類,合計涉及到5個大類、19個小類,其中涉及到翻譯相關(guān)基因的最多,有717個,膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因最少,有30個,具體結(jié)果如圖7所示。

圖7 KEGG代謝通路Fig.7 KEGG metabolic pathway注1:A:細(xì)胞進(jìn)程(Cellular processes);B:環(huán)境信息處理(Environmental information processing);C:遺傳信息處理(Genetic information processing);D:新陳代謝(Metabolism);E:生物系統(tǒng)(Organismal systems)。

2.2.2 差異表達(dá)基因KEGG富集結(jié)果 通過對各測序樣本的檢驗(yàn),不同大小的沙田柚之間篩選出差異表達(dá)基因969個,其中597個上調(diào)基因,372個基因表達(dá)下調(diào)。通過Pathway顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。差異表達(dá)基因涉及82個代謝通路,包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、淀粉與蔗糖代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、戊糖和葡糖醛酸鹽相互轉(zhuǎn)化和半乳糖代謝等。大小不同的沙田柚顯著富集的前20個代謝通路中,有10個與食味品質(zhì)直接相關(guān),2個與外觀品質(zhì)直接相關(guān)(表1)。

在富集到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異基因中,涉及7種植物激素和10個基因,這7種植物激素中,生長素(Aux/IAA、SAUR)、細(xì)胞分裂素(CRE1、A-ARR)、脫落酸(PYR/PYL)、油菜素內(nèi)酯(CYCD3)、茉莉酸(JAZ)相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào),乙烯(EIN3、MPK6)和水楊酸(TGA)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),激素和物質(zhì)代謝的相互作用可能是產(chǎn)生大小不同沙田柚品質(zhì)差異的原因。

表2 差異表達(dá)基因的代謝通路注釋Table 2 KEGG metabolic pathways annotation of differentially expressed genes

3 討論

3.1 沙田柚果實(shí)大小和品質(zhì)之間的關(guān)系

在沙田柚中,可溶性固形物是果實(shí)風(fēng)味和品質(zhì)的決定性物質(zhì),同時也是重要的能源物質(zhì),也可以作為中間產(chǎn)物參與到采后果實(shí)的物質(zhì)代謝中,調(diào)控果實(shí)的采后生理。研究表明,合適大小的臍橙果實(shí)品嘗風(fēng)味更好、可溶性固形物含量更高[14],小果的砂糖橘果實(shí)風(fēng)味和可溶性固形物含量高于大果[15],經(jīng)過存儲后的椪柑大果風(fēng)味更優(yōu)[16]。這些研究表明,大小對柑橘類水果可溶性固形物的影響受到遺傳因素的限制,不同的水果之間具有不同的特性。本研究中,大小適中的沙田柚可溶性固形物含量最高,與在臍橙中的研究結(jié)果類似,這一特性可能與在遺傳上沙田柚測序結(jié)果與臍橙有最高的相似度有關(guān)(32.6%)。

雖然柚子皮有一定的食用和加工價值[17],但柚子皮厚度增加可食率降低,果皮厚度這一性狀不利于沙田柚鮮食。本研究中,1200 g以下組別果皮厚度之間無顯著性差異(P>0.05),超過1200 g的組別隨著果實(shí)大小的增大,皮厚不斷增加。對于鮮食類果品,種子多仍然是一個不利性狀,陳建業(yè)等研究表明,少核沙田柚與多核沙田柚相比,單果質(zhì)量顯著性降低,可溶性固形物含量和果皮厚度極顯著降低,其原因可能是激素調(diào)節(jié)導(dǎo)致[18]。這一結(jié)果與本研究的結(jié)果類似,本研究側(cè)重點(diǎn)為果實(shí)大小,大小不同的果實(shí)來源于同遺傳背景的沙田柚,得出果重低的沙田柚核少、可溶性固形物含量低和果皮厚度低,結(jié)合采摘時轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果,本研究產(chǎn)生的結(jié)果也可能是種子可以分泌植物激素所導(dǎo)致。

3.2 大小不同的果實(shí)品質(zhì)差異可能的分子機(jī)理

果實(shí)發(fā)育是一個動態(tài)連續(xù)的過程,這一過程中任何一個階段的變化都可能對果實(shí)品質(zhì)產(chǎn)生影響[19],由于全過程的復(fù)雜性,本研究選取果形已經(jīng)確定、果實(shí)發(fā)育完全的這一個階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,試圖探尋果實(shí)大小與品質(zhì)產(chǎn)生差異可能的分子機(jī)理。

植物激素參與植物生長發(fā)育的各個階段,影響著果實(shí)品質(zhì)[20]。不論呼吸躍變型果實(shí)還是非呼吸躍變型果實(shí),乙烯和脫落酸(ABA)都有促進(jìn)果實(shí)成熟的作用,乙烯在這一過程中起到核心的作用[21-23],在沙田柚中的研究表明,外源乙烯對沙田柚采后品質(zhì)影響不大,但對沙田柚果實(shí)退綠有較大影響[6]。水楊酸有著促進(jìn)果實(shí)膨大、抑制果實(shí)成熟的所用,其作用機(jī)理可能是抑制乙烯合成完成,油菜素內(nèi)酯同樣通過抑制乙烯的合成延緩果實(shí)的成熟,生長素(IAA)、細(xì)胞分裂素在一定程度可以延緩果實(shí)的成熟衰老過程[24-27]。本研究發(fā)現(xiàn),富集最顯著的20條pathway中,14條涉及到風(fēng)味品質(zhì)相關(guān)的物質(zhì)代謝,2條涉及植物激素相關(guān),分別是植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和油菜素內(nèi)酯的生物合成,在小沙田柚和大沙田柚之間比較,涉及到生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的Aux/IAA基因和SAUR基因表達(dá)下調(diào),涉及細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的CRE1基因表達(dá)下調(diào),涉及油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的CYCD3基因表達(dá)下調(diào),茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組分JAZ基因表達(dá)下調(diào),同時涉及乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的核轉(zhuǎn)錄因子EIN3表達(dá)上調(diào),根據(jù)前人的研究結(jié)果,以上基因的變化可能促進(jìn)沙田柚果實(shí)的成熟,內(nèi)源乙烯的變化可能是大、小沙田柚品質(zhì)產(chǎn)生差異的重要原因。此外,ABA代謝受體PYR/PYL基因表達(dá)下調(diào),水楊酸代謝途徑中的TGA基因表達(dá)上調(diào),說明了激素調(diào)控果實(shí)品質(zhì)的復(fù)雜性,其具體機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

大小適中的沙田柚,即質(zhì)量在950～1000 g的沙田柚可溶性固形物含量高,1000 g以下沙田柚可溶性固形物含量值和沙田柚質(zhì)量極顯著正相關(guān)(P<0.01),950～1150 g之間極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),950～1200 g之間質(zhì)量和可溶性固形物含量之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。超過1200 g的組別,質(zhì)量和可溶性固形物含量之間相關(guān)系數(shù)沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。沙田柚果實(shí)質(zhì)量和種子數(shù)、縱徑、橫徑、皮厚度四個指標(biāo)極顯著正相關(guān)(P<0.01),種子數(shù)和可溶性固形物含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),和皮厚呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)?？扇苄怨绦挝锖恐党头N子數(shù)極顯著正相關(guān)(P<0.01)外,和果形指數(shù)同樣呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。對不同大小沙田柚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析,篩選出差異表達(dá)基因969個,其中597個上調(diào)基因,372個基因表達(dá)下調(diào),差異表達(dá)基因涉及82個代謝通路,激素和物質(zhì)代謝的相互作用可能是產(chǎn)生大小不同沙田柚品質(zhì)差異的原因。本結(jié)果可為沙田柚采前疏花疏果和采后激素調(diào)節(jié)提供參考。