李瑩 李小兵

摘要：目的? 研究從人脂肪組織中獲取人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）的方法，并觀察其形態(tài)特點(diǎn)、生物學(xué)特性、多譜系細(xì)胞分化的特點(diǎn)及間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞表面相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)，探討脂肪干細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞的臨床應(yīng)用前景。方法? 應(yīng)用Ⅰ型膠原酶消化分離人脂肪組織，分時(shí)間段收集細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng);采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD34、CD44、CD45、CD105等間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞表面相關(guān)標(biāo)志抗原的表達(dá);利用成脂、成骨及成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)hADSCs進(jìn)行定向分化誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)形態(tài)的變化，分別于誘導(dǎo)第11、14、21天進(jìn)行油紅O染色、茜素紅染色及阿爾新藍(lán)染色;采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)hADSCs的增殖功能。結(jié)果? ①原代培養(yǎng)的hADSCs接種48 h后大部分細(xì)胞貼壁，為多角形的單層細(xì)胞;第3代細(xì)胞分裂增殖旺盛，細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)且排列規(guī)律;第8～9代后細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞內(nèi)顆粒明顯增多。②第3代hADSCs的表面抗原標(biāo)記結(jié)果：CD29、CD44、CD105陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為98.89%、93.73%、86.99%;CD34、CD45陰性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為0.16%、0.11%。③hADSCs成脂誘導(dǎo)第11天、成骨誘導(dǎo)第14天、成軟骨誘導(dǎo)第21天時(shí)細(xì)胞分化達(dá)到高峰，油紅O染色、茜素紅染色、阿爾新藍(lán)染色均為陽(yáng)性;④第4、5、6代（P4、P5、P6）hADSCs隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，細(xì)胞平均從第24 h開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，三代之間細(xì)胞增殖功能比較： P4>P5，P6>P5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 本次成功從人脂肪組織中分離、培養(yǎng)出目的細(xì)胞，經(jīng)初步鑒定，證實(shí)其為hADSCs，同時(shí)成功對(duì)hADSCs進(jìn)行了成脂、成骨及成軟骨定向誘導(dǎo)分化。hADSCs的增殖能力可能會(huì)隨傳代次數(shù)的增加而有所下降;無(wú)血清刺激也可能會(huì)影響hADSCs的增殖功能，使其增殖能力有所下降。

關(guān)鍵詞：脂肪干細(xì)胞;定向誘導(dǎo)分化;細(xì)胞增殖

中圖分類(lèi)號(hào)：R329? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.027

文章編號(hào)：1006-1959（2020）01-0089-05

Study on Biological Characteristics and Differentiation of Human Fat Stem Cells

LI Ying，LI Xiao-bing

（Plastic and Burn Surgery，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300000，China）

Abstract：Objective? To study the method of obtaining human adipose stem cells （hADSCs） from human adipose tissue， and to observe its morphological characteristics， biological characteristics， characteristics of multi-lineage cell differentiation， and expression of relevant markers on the surface of mesenchymal-derived cells， and to explore adipose stem cells. Prospects for clinical application of tissue engineering seed cells. Methods? Human adipose tissue was isolated and digested with type I collagenase， and cells were collected in time and cultured in vitro. Flow cytometry was used to detect the expression of surface-associated marker antigens on cells such as CD29， CD34， CD44， CD45， and CD105; Adipogenic， osteogenic， and chondrogenic induction media induce directional differentiation of hADSCs. Observe the morphological changes of cells with prolonged induction time. Oil red 0 staining， alizarin red staining， and Al New blue staining; Cell Counting Kit-8 （CCK-8） cell proliferation detection kit was used to detect the proliferation function of hADSCs.Results? ① 48 h after inoculation of primary cultured hADSCs， most of the cells were adherent， and they were polygonal monolayer cells; the third-generation cells had vigorous division and proliferation， and the cells were slender and arranged regularly. After the 8th to 9th generations， the cell morphology was irregular and the intracellular particles increased significantly. ② Surface antigen labeling results of the third generation hADSCs： CD29， CD44， and CD105 were positively expressed， with positive rates of 98.89%， 93.73%， and 86.99%， respectively; CD34 and CD45 were negatively expressed， with positive rates of 0.16% and 0.11%， respectively. ③ hADSCs reached the peak of cell differentiation on the 11th day of adipogenic induction， the 14th day of osteogenesis induction， and the 21st day of chondrogenic induction， and oil red O staining， alizarin red staining， and alcin blue staining were all positive; ④The 4th， 5th， and 6 th generation （P4， P5， P6） hADSCs showed an increasing trend with the increase of culture time. The cells entered an exponential growth period from the 24 h on average. Comparison of cell proliferation functions between the three generations： P4> P5， P6> P5， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? The target cells were successfully isolated and cultured from human adipose tissue this time. After preliminary identification， they were confirmed to be hADSCs. At the same time， hADSCs were successfully induced into adipogenic， osteogenic and chondrogenic differentiation. The proliferative capacity of hADSCs may decrease with the increase of the number of passages; serum-free stimulation may affect the proliferative function of hADSCs and reduce their proliferative capacity.

Key words：Adipose stem cells;Directional induced differentiation;Cell proliferation

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）是一種來(lái)源于中胚層的細(xì)胞。目前研究表明，ADSCs具有和骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物學(xué)性狀和免疫表型，并且已經(jīng)證實(shí)其在體外具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等分化的能力，且其誘導(dǎo)分化的體系和骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞相似[1]。脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞除了具有間充質(zhì)干細(xì)胞的共性外，還具有以下特點(diǎn)[2]：脂肪組織來(lái)源廣泛、取材容易，如患者進(jìn)行局部麻醉后吸脂術(shù)即可獲得。不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞免疫活性不同可能與間充質(zhì)干細(xì)胞處于不同組織中的活化狀態(tài)、種屬差異、組織來(lái)源和培養(yǎng)條件的不同有關(guān)[3]。脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞不易受到腫瘤細(xì)胞的污染，更容易進(jìn)行體外凈化，具有免疫抑制作用。因此，從脂肪組織中獲得種子細(xì)胞，成為組織工程種子細(xì)胞的理想來(lái)源。人類(lèi)脂肪組織可通過(guò)切取或吸脂術(shù)獲得，由于吸脂術(shù)的微創(chuàng)性及美體作用，該方法可成為醫(yī)生及患者更容易接受的細(xì)胞獲取方式。本研究擬從人脂肪組織中獲取人脂肪干細(xì)胞（hADSCs），觀察其形態(tài)特點(diǎn)、生物學(xué)特性，并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)分化，探討其應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1材料來(lái)源? 成人脂肪組織來(lái)源于整形外科健康縮乳手術(shù)患者，均為女性，年齡19～40歲，無(wú)糖尿病、肝炎、代謝性疾病及其他系統(tǒng)性疾病，在知情同意的情況下，取術(shù)中廢棄脂肪組織。

1.2方法

1.2.1人脂肪干細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)? 將無(wú)菌條件下獲取的脂肪組織用PBS清洗，切成0.5 mm×0.5 mm無(wú)殘余血液、皮膚和纖維組織的碎片，37℃下在1 mg/ml膠原酶Ⅰ（Gibco，USA）中消化1～2 h。于1000 r/min離心5 min，去除上清液。將細(xì)胞懸浮在含有10%FBS（Hyclone，USA）的DMEM（Gibco，USA）中，37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。48 h后觀察粘附細(xì)胞。培養(yǎng)基每3 d更換1次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)進(jìn)行傳代，第3代細(xì)胞用于隨后的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2人脂肪干細(xì)胞表面抗原鑒定? 第3代細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA（sigma，USA）消化，懸浮于含0.1%BSA（sigma，USA）的PBS中，細(xì)胞密度為3.0×106/ml。將100 μl細(xì)胞懸液添加到2 mlEP管中，再將標(biāo)記抗體稀釋液（表1）加入到樣品管中。樣品在4℃下避光孵育30 min。孵育后，在每個(gè)樣品管中加入1.5～2 ml PBS和0.1%BSA。離心（244 g，? ? 4 min），將細(xì)胞懸浮于含0.1%BSA的PBS 400 μl溶液中進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3人脂肪干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化? ①成脂分化誘導(dǎo)：37℃的6孔培養(yǎng)板中加入第3代細(xì)胞，5%CO2培養(yǎng)基培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到100%融合。將原培養(yǎng)基替換為2 ml完全成脂培養(yǎng)基A（cyagen，USA）培養(yǎng)3 d，然后將其替換為完全成脂培養(yǎng)基B（cyagen，USA）培養(yǎng)24 h。介質(zhì)A和B交換重復(fù)3個(gè)周期。用10%中性福爾馬林固定30 min，1 ml油紅O工作液（Sigma，USA）染色10 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞。②成骨分化誘導(dǎo)：第3代細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到細(xì)胞融合80%～90%，替換為2 ml完全成骨分化培養(yǎng)基（Cyagen，USA），每3 d更換1次培養(yǎng)基。3周后用10%中性福爾馬林固定30 min，1 ml茜素紅（sigma，USA）染色5 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞。③成軟骨分化誘導(dǎo)：第3代細(xì)胞接種于離心管中，培養(yǎng)基為完全軟骨分化培養(yǎng)基（cyagen，USA），平均每管細(xì)胞數(shù)為2×105/ml。每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4周后，固定細(xì)胞進(jìn)行石蠟切片，阿爾新藍(lán)50～60℃染色15 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖? 分別取第4代（P4，無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓12 h）、第5代（P5，無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓12 h）、第6代（P6，未饑餓）脂肪干細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml。96孔板中每孔2000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)8個(gè)平行復(fù)孔，共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)。計(jì)算所需細(xì)胞總數(shù)和液體總量，鋪板。分別于12、24、36、48、60、72 h后取出96孔板加入CCK-8溶液，每孔10 μl，檢測(cè)各孔的吸光度值;在酶標(biāo)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)，檢測(cè)各孔的吸光度值D450。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，將只含加培養(yǎng)基不加細(xì)胞作為空白對(duì)照孔調(diào)零。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)均為方差齊;當(dāng)各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，任意兩組比較用LSD-t法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1人脂肪干細(xì)胞的形態(tài)觀察? 細(xì)胞接種48 h后可見(jiàn)大部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁，為多角形的單層細(xì)胞。有的細(xì)胞體細(xì)長(zhǎng)，似成纖維細(xì)胞（圖1-A1）。72 h后大多數(shù)細(xì)胞貼壁，并開(kāi)始伸展、分裂，呈梭形（圖1-A2）。5～7 d后細(xì)胞逐漸分裂、融合成單層并鋪滿瓶底? ? ?（圖1-A3）。傳代后細(xì)胞呈梭形，核居中，多數(shù)為1個(gè)核仁，也可雙核仁，呈圓形或卵圓形，細(xì)胞成簇分布，排列有一定的極性（圖1-B1）。細(xì)胞平均傳代擴(kuò)增時(shí)間約為3 d，第3代細(xì)胞分裂增殖旺盛，細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，排列緊湊且規(guī)律（圖1-B2）。第8～9代以后，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，缺乏立體性，細(xì)胞邊緣融合不清，胞內(nèi)顆粒明顯增多，培養(yǎng)液中可見(jiàn)較多的細(xì)胞碎片（圖1-B3）。

2.2人脂肪干細(xì)胞的表面抗原鑒定結(jié)果? 第3代人脂肪干細(xì)胞的表面抗原標(biāo)記結(jié)果：CD29、CD44、CD105陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為98.89%、93.73%、86.99%;CD34、CD45陰性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為0.16%、0.11%，見(jiàn)圖2。

2.3人脂肪干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化結(jié)果

2.3.1成脂誘導(dǎo)分化? 成脂誘導(dǎo)72 h后，鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞立體感增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)有小脂滴出現(xiàn)（圖3-A1），約1周后脂滴數(shù)量增加并相互融合，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形或多邊形（圖3-A2），誘導(dǎo)第11天時(shí)，細(xì)胞分化達(dá)到高峰，可見(jiàn)大量脂滴融合成團(tuán)（圖3-A3），油紅O染色陽(yáng)性，顯示有大量脂質(zhì)沉淀（圖3-A4）。

2.3.2成骨誘導(dǎo)分化? 誘導(dǎo)第4天細(xì)胞呈多角形，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒增多;第8天胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞間見(jiàn)鈣質(zhì)沉積（圖3-B1，箭頭）;第12天細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯（圖3-B2，箭頭）;第14天誘導(dǎo)分化達(dá)到高峰，可見(jiàn)大量鈣沉積，并融合成片（圖3-B3，箭頭），茜素紅染色陽(yáng)性，呈紅色結(jié)節(jié)（圖3-B4，箭頭）。

2.3.3成軟骨誘導(dǎo)分化? 誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞成小顆粒狀漂浮在誘導(dǎo)液中，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，在細(xì)胞密度較大處細(xì)胞群逐漸聚集;誘導(dǎo)第7天即可在聚集細(xì)胞的表面看到微黃色的物質(zhì)積累，量逐漸增多;誘導(dǎo)第21天達(dá)到高峰，阿爾新藍(lán)染色陽(yáng)性（圖3-C1、C2）。

2.4 hADSCs的增殖功能? 第4代細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，均呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。從第24 h開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，各時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞平均吸光度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.230，P<0.05）;其中細(xì)胞平均吸光度值在36 h比24 h增加了28.00%，60 h比48 h增加了21.88%。第5代細(xì)胞從第48 h開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，各時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞平均吸光度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.525，P<0.05），細(xì)胞平均吸光度值在60 h時(shí)比48 h增加了38.46%，72 h比60 h增加了72.22%。第6代細(xì)胞從第24 h開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，各時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞平均吸光度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.890，P<0.05），其中細(xì)胞平均吸光度值36 h比24 h增加了71.43%。見(jiàn)圖4A。

不同代數(shù)之間細(xì)胞增殖功能比較，細(xì)胞平均吸光度值的趨勢(shì)為：P4>P5，P6>P5，三代之間兩兩比較，各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.855、13.976、58.260、52.616、38.616、11.573，P均<0.05）。見(jiàn)圖4B。

3討論

軟骨、心肌、神經(jīng)等組織由于缺乏再生能力，其損傷修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)為解決這一難題提供了可能，其核心是建立由種子細(xì)胞和支架構(gòu)成的三維空間復(fù)合體。其中，種子細(xì)胞的選擇非常重要，與胚胎干細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞由于無(wú)倫理爭(zhēng)議，更適合作為組織工程的種子細(xì)胞。目前，在成體干細(xì)胞中，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的研究開(kāi)展較早，并已作為種子細(xì)胞進(jìn)行了組織工程方面的相關(guān)研究。但取骨髓時(shí)患者比較痛苦，而且可獲得的MSC數(shù)量甚少，要以體外擴(kuò)增來(lái)得到足夠的細(xì)胞數(shù)，所需周期長(zhǎng)且造價(jià)昂貴。隨著MSC研究的不斷深入，人們對(duì)MSC的生物學(xué)特性、分化能力及臨床應(yīng)用有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織位于較易獲得的結(jié)締組織內(nèi)，和骨髓一樣來(lái)源于間充質(zhì)，其中存在的一類(lèi)干細(xì)胞族的克隆細(xì)胞株稱(chēng)為脂肪干細(xì)胞（ADSCs）。這些細(xì)胞可以從脂肪組織中大量分離，和MSCs一樣具有多向分化潛能，在一定條件下可以向脂肪、骨、軟骨、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化。而相比MSCs，ADSCs具有的優(yōu)點(diǎn)是：取標(biāo)本時(shí)患者痛苦小;細(xì)胞含量豐富，每單位體積脂肪組織中含有多分化潛能細(xì)胞的數(shù)量約是骨髓組織的500倍以上;不需進(jìn)行長(zhǎng)期的體外擴(kuò)增。因此，ADSCs體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，傳代培養(yǎng)易于獲得大量有分化能力的細(xì)胞[5]，其可能更適合作為組織工程的種子細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100 ml脂肪組織可產(chǎn)生約2×107個(gè)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)中，平均倍增時(shí)間約為2～3 d，并能保持穩(wěn)定的倍增率至第8代。這表明ADSCs的增殖能力很強(qiáng)，傳代培養(yǎng)時(shí)易于獲得大量有分化能力的細(xì)胞。ADSCs與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，且都無(wú)特異性的鑒別標(biāo)志。有研究將脂肪組織和結(jié)締組織用膠原酶消化后，比較兩者獲得的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：脂肪來(lái)源的細(xì)胞內(nèi)脂肪聚成大滴，成纖維細(xì)胞只有少量的脂滴，且30%～40%的原代ADSCs能自發(fā)生成脂肪細(xì)胞，提示原代分離的細(xì)胞來(lái)源于脂肪基質(zhì)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和換液次數(shù)的增加，這些細(xì)胞基本可被清除，說(shuō)明應(yīng)用以上原代細(xì)胞培養(yǎng)法可從人脂肪組織中分離出hADSCs，并可進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。

目前，ADSCs尚缺乏特異性的表面標(biāo)記物，常用的鑒定方法有免疫組化染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原等，但采用單一檢測(cè)方法來(lái)鑒定ADSCs是不全面的。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物的檢測(cè)和成脂、成骨、成軟骨定向誘導(dǎo)等實(shí)驗(yàn)對(duì)ADSCs進(jìn)行初步鑒定。ADSCs表面標(biāo)志蛋白主要有CD9、CD10、CD13、CD29、CD34、CD44、 CD105、CD106、CD146、CD166、HLA-ABC，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后ADSCs雖表現(xiàn)出成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等已分化細(xì)胞的特征，但表面蛋白的表達(dá)卻與未分化前基本一致。這些表面蛋白與MSCs的表面蛋白很相似，CD29、CD44、CD71、CD70、CD105等為陽(yáng)性標(biāo)記，CD31、CD34、CD45等為陰性標(biāo)記。CD45在內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中有表達(dá)，而ADSCs不表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)第3代hADSCs的表面抗原標(biāo)記結(jié)果為CD29、CD44、CD105陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為98.89%、93.73%、86.99%;CD34、CD45陰性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為0.16%、0.11%。

ADSCs與MSCs類(lèi)似，在不同的培養(yǎng)條件下可分化為不同的中胚層來(lái)源的組織細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中分別加入成脂、成骨及成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時(shí)間后進(jìn)行特異染色，結(jié)果均為陽(yáng)性，證實(shí)其具有多向分化潛能。本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞置于離心管內(nèi)進(jìn)行立體培養(yǎng)，相比單層平面培養(yǎng)更利于其向軟骨定向分化。不同代數(shù)之間細(xì)胞增殖功能比較顯示：細(xì)胞平均吸光度值的趨勢(shì)為：P4>P5，P6>P5。分析原因：P4、P5和P6細(xì)胞培養(yǎng)的血清條件不同，P4、P5均在測(cè)增殖功能前用無(wú)血清的培養(yǎng)基饑餓12 h，而P6細(xì)胞無(wú)低血清饑餓刺激，說(shuō)明同一血清條件下，隨著代數(shù)的增加hADSCs增殖能力有所下降;不同血清條件下，無(wú)血清刺激可以影響hADSCs的增殖功能，其增殖能力有所下降。

研究干細(xì)胞增殖和分化機(jī)制的最終目的是應(yīng)用干細(xì)胞治療疾病，干細(xì)胞具有的多向分化潛能和自我更新能力使其成為未來(lái)再生醫(yī)學(xué)的重要種子細(xì)胞，并成為研究人類(lèi)早期胚層特化和器官形成、藥物篩選以及基因治療的最佳工具。利用胚胎干細(xì)胞治療疾病有著廣泛的應(yīng)用前景，但它的應(yīng)用還受到社會(huì)倫理方面的制約。而成體干細(xì)胞橫向分化的發(fā)現(xiàn)對(duì)于細(xì)胞研究和應(yīng)用具有重要意義，從患者體中分離出成體干細(xì)胞，在體外定向誘導(dǎo)分化為特定組織細(xì)胞，將這些細(xì)胞自體移植回輸該患者體內(nèi)，從而達(dá)到長(zhǎng)期治療的目的。干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)應(yīng)用還包括體外克隆人體器官，然而這比體內(nèi)移植干細(xì)胞要復(fù)雜的多。相信隨著研究的不斷深入，來(lái)自人體干細(xì)胞的器官應(yīng)用于臨床治療已為期不遠(yuǎn)。干細(xì)胞研究與應(yīng)用不僅在疾病治療方面有著極其誘人的前景，還將對(duì)克隆動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)、發(fā)育生物學(xué)、新藥物的開(kāi)發(fā)與藥效和毒性評(píng)估等領(lǐng)域產(chǎn)生極其重要的影響。

綜上所述，本研究成功分離培養(yǎng)出hADSCs，對(duì)hADSCs進(jìn)行了成脂、成骨、成軟骨的定向誘導(dǎo)分化;并研究了細(xì)胞的增殖功能，初步探討了脂肪來(lái)源干細(xì)胞作為構(gòu)建組織工程種子細(xì)胞的可行性，同時(shí)對(duì)干細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞臨床應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

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收稿日期：2019-10-15;修回日期：2019-11-05

編輯/成森