林默楠，呂巖紅綜述，鄭金華審校

0 引 言

聲敏劑是一類可預(yù)留在腫瘤局部，被超聲激活，可使腫瘤部位產(chǎn)生一系列聲化學(xué)反應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)，從而達到抑制和殺傷腫瘤細胞目的的化合物[1]。二者聯(lián)合的抗癌療法，稱為聲動力治療(sonodynamic therapy, SDT)。與傳統(tǒng)的抗癌療法相比，超聲聯(lián)合聲敏劑的抗癌治療具有無創(chuàng)性、靶向性強和方便操作等優(yōu)點。與新型腫瘤療法如生物療法相比[2]，SDT療法相對簡單可控，如果獲得臨床應(yīng)用，將適用于治療患有深部腫瘤或不能耐受手術(shù)和放、化療的癌癥患者。在這一療法的發(fā)展過程中，有人選用高能量超聲(頻率>1 MHz，強度>3 W/cm2)，特別是高強度聚焦超聲與聲敏劑結(jié)合。但由于高強度聚焦超聲波可使靶區(qū)組織溫度驟升至65100 ℃，導(dǎo)致組織細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)出現(xiàn)變性或凝固性壞死，進而使機體產(chǎn)生不良的免疫反應(yīng)[3]。目前，學(xué)者們更多地選用低能量非熱超聲(≤1 MHz，≤3 W/cm2)，不僅能激活聲敏劑達到抑瘤效果，還能最大限度地減輕超聲對正常組織的不良反應(yīng)。利用超聲非侵襲、無毒性且便于定位局部深層組織的特點，因此在臨床的應(yīng)用上具有廣泛的空間[4-5]?？梢员欢x為聲敏劑的化合物在一定劑量范圍內(nèi)對組織細胞無毒或毒性較小，但與超聲結(jié)合可顯示出協(xié)同增強的抑癌作用。研究表明，聲敏劑的種類、結(jié)構(gòu)、濃度、溶解性、體內(nèi)代謝時間、在腫瘤細胞內(nèi)富集程度及亞細胞作用位點的不同均可影響SDT的作用效果和抑癌機制[4-6]。因此，開發(fā)用于腫瘤治療的理想聲敏劑是SDT療法必須解決的重要問題之一。用作腫瘤SDT治療的理想的聲敏劑應(yīng)該具備本身無毒、具有良好的組織相容性；體內(nèi)給藥方便，不在體內(nèi)長時間滯留；低或無光毒性；有較強的聲敏活性，并具有化學(xué)的純性，可以迅速從體內(nèi)排出等特點。本文從不同種類聲敏劑的生物化學(xué)特點對其聯(lián)合超聲的SDT治療效果影響的角度，比較了卟啉類及非卟啉類化合物與超聲聯(lián)合殺傷腫瘤細胞的聲化學(xué)及生物機制的異同點，為聲敏劑的設(shè)計開發(fā)、聲敏劑的基礎(chǔ)實驗研究提供可能的指導(dǎo)和理論基礎(chǔ)。

1 卟啉類化合物及其衍生物與超聲聯(lián)合的抗腫瘤效果及機制

卟啉類化合物是一類由四個吡咯類亞基的α-碳原子通過次甲基橋相連而成的平面環(huán)狀共軛體系，以卟吩為其共同結(jié)構(gòu)，連有不相同側(cè)鏈的卟吩稱為卟啉。卟啉及其衍生化合物廣泛存在于生物體內(nèi)和能量轉(zhuǎn)移的相關(guān)的重要細胞器內(nèi)，因其具有較好的生物相容性和低細胞毒性，是理想聲敏劑的候選。

1.1血卟啉和光卟啉Ⅱ血卟啉(598.7 g/mol)是由血紅蛋白酸水解后產(chǎn)生的內(nèi)源卟啉，可從血液中提取，是最早被發(fā)現(xiàn)具有聲敏活性的物質(zhì)。研究報道特異聚集于腫瘤局部的血卟啉，在超聲作用下可誘導(dǎo)腫瘤細胞線粒體產(chǎn)生單線態(tài)氧(1O2)，引起腫瘤細胞凋亡[7]。光卟啉Ⅱ(1179.385 g/mol)是多種卟啉單體和多聚體的混合物，光卟啉Ⅱ(2.5 mg/kg和5.0 mg/kg)結(jié)合超聲(3和5 W/cm2)可將肝癌AH130鼠移植瘤的大小抑制在10 mm之內(nèi)(長短徑平均值)，最高抑制率達75%以上，同時，光卟啉Ⅱ也表現(xiàn)出選擇性地在腫瘤組織中累積的特點[8]。然而，由于光卟啉Ⅱ不溶于水，導(dǎo)致其在血液中的消除速度快于腫瘤中的累積速率，因而在體內(nèi)腫瘤部位聚集的效率較低。上述研究顯示血卟啉和光卟啉Ⅱ介導(dǎo)的SDT中使用的超聲的強度以及藥物劑量都相對較高(2 MHz，2 W/cm2和3 W/cm2)，表明這兩種聲敏劑的聲敏活性較低。

1.2血卟啉單甲醚(haematoporphyrin-monomethyl Ether，HMME)和原卟啉IX(protoporphyrin IX，PpIX)HMME(612.727 g/mol)和PpIX(562.67 g/mol)都是由血卟啉的卟啉單體混合物進一步純化而分離出的物質(zhì)，被稱為血卟啉衍生物。HMME能夠分布至腫瘤細胞的線粒體中，被超聲激活產(chǎn)生活性氧，進一步誘發(fā)線粒體介導(dǎo)的凋亡的發(fā)生[9]，并在同一實驗中可觀察到腫瘤細胞中鈣離子的失調(diào)和caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達和腫瘤細胞凋亡。此外，高濃度HMME(120 μg/mL)聯(lián)合超聲導(dǎo)致細胞壞死，但相關(guān)機制不清[10]。

藥物代謝的體外實驗顯示，外源性PpIX孵育60 min，細胞內(nèi)PpIX的富集水平最高，當PpIX被超聲激活后可與分子氧相互作用產(chǎn)生具有細胞毒活的活性氧，特別是1O2，導(dǎo)致細胞膜的破壞，體內(nèi)外的實驗證實這一破壞將影響線粒體的功能和導(dǎo)致染色質(zhì)的凝集，導(dǎo)致腫瘤細胞G2/M期阻滯的同時，通過Fas信號通路誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，從而引起靶向腫瘤組織不可逆性的損傷[4, 11]。2.5 mg/mL(～4000 μmol/L)的血卟啉，20 μmol/L的PpIX以及60 μg/mL(～96 μmol/L)的HMME與強度1～2 W/cm2超聲結(jié)合作用于不同腫瘤細胞，均顯示出50%以上的腫瘤抑制率。提示使用濃度較低的PpIX和HMME具有更好的聲敏活性[12-13]。但兩者受限于易產(chǎn)生光毒性、在生物體內(nèi)的相容性差等缺點，許多研究者利用微泡和納米技術(shù)來提高它們對腫瘤細胞的親和性以及代謝率，以理想聲敏劑為標準來提高它們在SDT中的應(yīng)用價值。

1.35-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)5-ALA(131.131 g/mol)是內(nèi)源性PpIX的小分子代謝前體，比PpIX更容易進入細胞[4]。在正常情況下，機體內(nèi)的5-ALA受到反饋調(diào)節(jié)的控制，體內(nèi)沒有過量的5-ALA蓄積，但當外源性5-ALA進入體內(nèi)后，能被惡性腫瘤細胞選擇性吸收，在惡性腫瘤細胞內(nèi)合成過量的PpIX。與傳統(tǒng)的卟啉類聲敏劑相比，5-ALA不具有卟啉的四重吡咯結(jié)構(gòu)，避免了其疏水性。5-ALA的這種特性使其在鼠的體內(nèi)實驗中可以進行多種給藥方式：如腹腔注射，經(jīng)胃途徑和口服等[14]。相關(guān)的對比實驗顯示[4]，5-ALA產(chǎn)生的內(nèi)源性PpIX對小鼠肉瘤S180細胞的毒性高于同濃度的外源性PpIX，當超聲強度為3 W/cm2時，二者結(jié)合超聲可顯著抑制腫瘤細胞的活性，但二者聯(lián)合治療的腫瘤抑制率并未有顯著差別。同時發(fā)現(xiàn)外源性PpIX在孵育細胞的1 h后，不再進入(附著)細胞，而5-ALA在細胞內(nèi)產(chǎn)生的PpIX濃度在12 h內(nèi)隨著孵育時間不斷增加，單獨應(yīng)用5-ALA對細胞的毒性更強，說明5-AlA產(chǎn)生了其他額外效應(yīng)，聲動力效果不及PpIX。并且這些研究都顯示，5-ALA結(jié)合超聲可誘導(dǎo)活性氧和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，引起腫瘤細胞內(nèi)線粒體膜電位的喪失，抑癌作用與線粒體凋亡機制有關(guān)[14-16]；另一方面，由于5-ALA在不同細胞周期內(nèi)源生成PpIX的量不同，線粒體凋亡途徑受細胞周期蛋白Cyclin A的調(diào)控[6]。由于5-ALA本身不具有光敏特性，避免了直接應(yīng)用卟啉類聲敏劑產(chǎn)生的光毒副作用，并且可以有多種體內(nèi)給藥方式，因此，在SDT治療中具有較好的應(yīng)用前景。

1.4卟啉衍生物早期通過對卟啉衍生物:鎵卟啉(1176.115 g/mol)，DCPH-P-Na(I)(797.645 g/mol)和錳卟啉(～858.800 g/mol)的特性的研究進行對比，發(fā)現(xiàn)它們對超聲的敏感性不同。鎵卟啉在腫瘤中的濃度顯著的大于血漿、皮膚和肌肉，單線態(tài)氧在鎵卟啉介導(dǎo)的SDT誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡中起重要作用[17-18]。與鎵卟啉相比，DCPH-P-Na(I)在同波長光激發(fā)下的熒光值較小。DCPH-P-Na(I)可由PpIX二甲酯合成而來，其具有一定的細胞毒性和低光敏感性，同時單線態(tài)氧的產(chǎn)生和誘導(dǎo)細胞凋亡也是DCPH-P-Na(I)介導(dǎo)SDT導(dǎo)致腫瘤細胞死亡的主要原因[19]。錳卟啉也是另一種基于卟啉結(jié)構(gòu)而進行修飾的衍生物，錳卟啉介導(dǎo)的SDT在體外實驗中顯示出能夠誘導(dǎo)細胞壞死而非細胞凋亡的能力。體內(nèi)動物實驗的數(shù)據(jù)顯示錳卟啉在聯(lián)合超聲能夠顯著地抑制腫瘤生長，并且沒有出現(xiàn)由于光敏感性而導(dǎo)致的皮膚毒性[20]。上述研究提示，通過適當?shù)慕Y(jié)構(gòu)修飾可消除或降低聲敏劑的光毒性。

1.5華卟啉鈉研究人員通過對一代光敏劑卟啉類各種衍生物的進一步篩選和純化，發(fā)現(xiàn)一種通過醚鍵連接的卟啉二聚體具有很強的光敏性和聲敏性，被命名為華卟啉鈉(sinoporphyrin sodium，DVDMS，1230.65 g/mol)[21-23]。自2012年DVDMS被合成以來，對其性質(zhì)和作用效果進行了一系列研究。與血卟啉和PpIX相比，DVDMS具有更高的吸收效率，與超聲結(jié)合可產(chǎn)生更多的活性氧，導(dǎo)致更強的線粒體損傷[5]。DVDMS-SDT治療的體外實驗顯示，在相同的濃度和孵育時間下，DVDMS在S180細胞中產(chǎn)生的熒光強度顯著高于血卟啉和外源性PpIX[24]。在ECA-109細胞中，DVDMS的熒光強度是血卟啉、PpIX和光卟啉Ⅱ的10倍，1 μmol/L的DVDMS聯(lián)合超聲對細胞的活性的抑制率大于50%，而血卟啉則需要32 μmol/L與超聲結(jié)合才能產(chǎn)生等效抑制作用，暗示了DVDMS在腫瘤細胞的高效富集，使其能夠發(fā)揮更強的抗腫瘤作用[5]。此外，有研究報道DVDMS介導(dǎo)的SDT在處理H446 小細胞肺癌細胞時抑制了壞死性凋亡的發(fā)生，且對各器官轉(zhuǎn)移有顯著的抑制作用[25]。最近的研究顯示，DVDMS參與的SDT治療對肝癌細胞的促凋亡作用與活性氧的生成和腫瘤抑制基因p53的表達相關(guān)[22]。研究表明與正常的組織細胞相比，DVDMS更傾向分布于腫瘤細胞且在腫瘤組織中有較長的滯留時間，這證明DVDMS具有很好的脂溶和水溶的兩親性，同時對腫瘤細胞具有選擇性[5]，這些性質(zhì)讓DVDMS相比于其他卟啉類化合物和衍生物，更具有臨床應(yīng)用的潛質(zhì)。同樣的，最近的實驗通過納米技術(shù)對DVDMS進行修飾，但是這一實驗不僅進一步增強了修飾聲敏劑的SDT效率，更增加了聲敏劑的成像檢測能力[26]。

2 非卟啉類化合物與超聲聯(lián)合的抗腫瘤效果及機制

非卟啉類化合物包括氧雜蒽類、非甾體類抗炎藥、第二代喹諾酮類抗生素、化療藥物、染料色素和無機納米粒子等，與超聲結(jié)合也表現(xiàn)出協(xié)同增強的抗腫瘤作用。目前還沒有具體證據(jù)表明非卟啉類化合物在超聲激發(fā)下是如何表現(xiàn)出聲敏活性，推斷高能π鍵在其結(jié)構(gòu)中起著重要作用。

2.1氧雜蒽類氧雜蒽類化合物，主要是一些以氧雜蒽環(huán)為骨架的染料，包括熒光素、曙紅和羅丹明。其中在抗腫瘤治療中研究最為廣泛的是熒光素玫瑰紅(rose bengal，RB，1017.628 g/mol)，其細胞毒效應(yīng)能被超聲明顯增強，并產(chǎn)生單線態(tài)氧等活性氧類物質(zhì)。在星形膠質(zhì)細胞的小鼠移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)由RB結(jié)合聚焦超聲，在不傷及正常腦組織的情況下，通過破壞細胞間連接，增強了單純超聲輻照對鼠顱內(nèi)惡性星形膠質(zhì)細胞瘤的抑制作用[27]。進一步的研究顯示，經(jīng)修飾的雙親性的RB衍生物與超聲聯(lián)合具有更好抗腫瘤效果，其衍生物之一RBD3與RB本身相比，在聯(lián)合超聲的作用下產(chǎn)生的單線態(tài)氧的數(shù)量和對S180細胞抗腫瘤效應(yīng)增加了一個數(shù)量級[28]。

2.2化療藥物和抗生素關(guān)于超聲能夠增強化療藥物的作用一直備受學(xué)者們的關(guān)注。目前已被證實具有聲敏活性的抗腫瘤藥物有多柔比星(543.525 g/mol)和順鉑(300.046 g/mol)等化療藥物[29-30]。由于它們本身具有細胞毒性，因此，聲敏性可能是一種附加的增強作用。相關(guān)的實驗表明，多柔比星結(jié)合超聲可增強超聲的空化作用、誘導(dǎo)活性氧和羥自由基生成、DNA損傷和細胞凋亡[31]。進一步體內(nèi)實驗的研究表明，多柔比星可以通過降低SHH和Gli-1來降低MMP-2/9在瘤周組織中的表達，導(dǎo)致膠原蛋白在細胞外基質(zhì)中沉積，抑制腫瘤細胞的生存和入侵，表明多柔比星介導(dǎo)的SDT能夠同時影響細胞外基質(zhì)的沉積和腫瘤細胞的活性[30]。此外，最近發(fā)現(xiàn)一些具有抗癌作用的中藥成分，如野黃芩苷(462.37 g/mol)等，與低強度超聲結(jié)合也可增強其抗癌效果[32]。

第二代喹諾酮類抗生素，如環(huán)丙沙星(331.35 g/mol)等聯(lián)合超聲也具有協(xié)同的抗腫瘤效應(yīng)[33-34]。研究表明，含氟和甲氧基的喹諾酮類化合物可在超聲的作用下首先生成自由基。并且，喹諾酮類抗生素單獨作用S180細胞，沒有細胞毒性，但結(jié)合強度為2 W/cm2的超聲后，腫瘤細胞的存活率隨超聲輻照的時間明顯降低[33]。

2.3染料、色素和無機納米材料酞菁染料(～1168.626 g/mol)作為光動力治療的第二代光敏劑，具有平面大環(huán)共價系統(tǒng)，和卟啉環(huán)類似，也作可為聲敏劑用于SDT的研究。鄰苯二甲酰亞氨基酞菁鋅染料是一種具有鋅原子配體的酞菁類衍生物，研究發(fā)現(xiàn)，它能明顯增強超聲對人U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的殺傷作用[35]，抗癌機制涉及活性氧的產(chǎn)生和隨后發(fā)生的線粒體及死亡受體5途徑介導(dǎo)的細胞凋亡。

其他一些染料，如亞甲基藍(319.851 g/mol)、吖啶橙(265.36 g/mol)、吲哚箐綠(774.967 g/mol)和竹紅菌素B(～542.50 g/mol)，在與超聲聯(lián)合治療腫瘤中顯示具有一定的聲敏性，并能夠誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生[36-37]。例如，竹紅菌素B被超聲激活可使細胞產(chǎn)生活性氧，并誘導(dǎo)SGC7901和抗藥型SGC7901/ADR胃腺癌細胞的凋亡[36]。此外，在光動力治療中使用的姜黃素(368.385 g/mol)、大黃素(270.24 g/mol)和富勒烯(～1000 g/mol)等也被發(fā)現(xiàn)具有不同程度的聲敏活性[38-41]，分別能夠?qū)е录毎允?、凋亡和壞死的作用?/p>

最近幾年，研究者們不僅將納米技術(shù)應(yīng)用于對現(xiàn)有聲敏劑的修飾上[26, 42-44]，同時，也發(fā)現(xiàn)一些無機的納米分子可以直接作為聲敏劑應(yīng)用于SDT治療[45-47]。例如，通過修飾過的二氧化鈦(79.9 g/mol)納米顆粒，解決它在體內(nèi)的生物兼容性問題，與超聲聯(lián)合應(yīng)用能夠誘發(fā)腫瘤細胞產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[48]，亦可致腫瘤局部組織壞死[49]。

值得注意的是，不同于卟啉類聲敏劑，許多非卟啉類聲敏劑本身具有一定的細胞毒性，不完全具備作為SDT治療理想聲敏劑的特點。這類聲敏劑在介導(dǎo)SDT時具有增強的抗癌作用可歸因于超聲的聲孔效應(yīng)，需要我們進一步深入研究。

3 結(jié) 語

聲敏劑聯(lián)合超聲的SDT治療作為一種新的非侵入性治療方法，近年來備受學(xué)者們的關(guān)注。利用體內(nèi)、外的實驗所得到聲敏劑的吸收峰值，以及聲敏劑在細胞內(nèi)的定位，使研究人員掌握最佳治療窗口。大量的細胞和動物實驗顯示，不同種類的聲敏劑結(jié)合超聲作用于不同的腫瘤細胞可產(chǎn)生不同的聲化學(xué)反應(yīng)，如空化效應(yīng)和聲孔效應(yīng)。其中90%以上的聲敏劑聯(lián)合超聲會產(chǎn)生單線態(tài)氧和羥基自由基等活性氧簇。這些活性氧簇的產(chǎn)生，會對局部的腫瘤組織和細胞產(chǎn)生不同形式的損傷[4]；例如對細胞膜的損傷誘發(fā)膜受體凋亡的發(fā)生[11]，對線粒體的損傷誘發(fā)內(nèi)源性凋亡的發(fā)生[16,50]，以及誘導(dǎo)腫瘤細胞壞死或自噬等。由于動物試驗結(jié)果只能證明聲動力方法的有效性而不能根據(jù)動物試驗的結(jié)果來制定對人的治療方案。未來可利用世界上認同的動物(載脂蛋白E基因敲除鼠或豬模型)探究聲敏劑的腫瘤靶向性和劑量等治療數(shù)據(jù)，將為人類治療腫瘤設(shè)計提供必要的聲敏劑參數(shù)。

因此，我們在篩選適合不同腫瘤細胞超聲參數(shù)(對正常組織器官無或低殺傷效應(yīng)，聯(lián)合聲敏劑誘導(dǎo)腫瘤細胞的死亡方式以凋亡為主)的同時，應(yīng)對不同聲敏劑的結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)、生物體組織和細胞代謝等方面與SDT不同的促腫瘤細胞死亡方式關(guān)系的進行探索，深入理解SDT的作用機制，為可用于臨床治療的聲敏劑的設(shè)計、研發(fā)及化學(xué)合成創(chuàng)造條件。