邱 楊 張 菁

少突膠質(zhì)細(xì)胞是大腦白質(zhì)中最為重要的膠質(zhì)細(xì)胞，它們包繞神經(jīng)元軸突形成髓鞘，為軸突的生長提供營養(yǎng)支持，同時由于髓鞘的絕緣作用使得神經(jīng)元電信號的傳播更為迅速[1]。少突膠質(zhì)細(xì)胞對于諸如腦缺血導(dǎo)致的興奮性氨基酸以及氧化應(yīng)激十分敏感，急性腦缺血或長期低灌注狀態(tài)都會導(dǎo)致嚴(yán)重的白質(zhì)損傷[2]。作為補(bǔ)償效應(yīng)，損傷周圍或者新生細(xì)胞聚集的腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)中的OPCs可以增殖、遷移到損傷部位，重新分化成熟，最后形成新的髓鞘[3, 4]。然而，構(gòu)建腦白質(zhì)缺血性損傷與再生的動物模型難度較大，模型的影響因素也較為復(fù)雜，且構(gòu)建如慢性低灌注損傷模型費時久。而作為條件更為可控的體外模型，建模難度小、費時短，因此能較快篩選出有前景的藥物。本文旨在對少突膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷與再生的體外模型的建立方法以及優(yōu)缺點進(jìn)行綜述，以期對后續(xù)實驗有所幫助。

一、OPCs體外缺血模型

1.少突膠質(zhì)細(xì)胞體外活力或功能試驗:腦缺血或者長期低灌注損傷會造成過谷氨酸過度釋放導(dǎo)致的興奮性毒性、組織血氧下降以及營養(yǎng)因子下降。為了模擬這些損傷，體外模型中有谷氨酸興奮性毒性損傷(培養(yǎng)液中添加谷氨酸 24h)、饑餓(去除原培養(yǎng)液中OPCs生長必須的營養(yǎng)因子)、糖氧剝奪實驗(將細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱且細(xì)胞液換位無糖培養(yǎng)基 4h，4h后恢復(fù)正常培養(yǎng)稱為復(fù)灌)以及在培養(yǎng)基中添加7天亞致死量的CoCl2來誘導(dǎo)長時間化學(xué)缺氧的這幾種模型[5～8]。首先，制備純化的OPCs方法如下[9]：從出生后的第2天的SD大鼠斷頭取腦，冰上分離大腦皮質(zhì)，胰酶消化腦組織后，得到的混合膠質(zhì)細(xì)胞在Neurobasal培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，補(bǔ)充有血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor AA, PDGF-AA)和堿性成纖維細(xì)胞(basic fibroblast growth factor，bFGF)生長因子3天。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底時，兩次梯度離心去除小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞后得到純化的OPCs。這些純化培養(yǎng)的細(xì)胞可以通過神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞抗原2(neuron-glia antigen 2, NG2)的免疫熒光染色鑒定，超過95%的培養(yǎng)細(xì)胞是OPCs。然后將純化培養(yǎng)后的OPCs放入以上描述的各體外損傷模型中。損傷的同時還可以添加藥物共同孵育，通過對少突膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的觀察(凋亡的少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞與細(xì)胞間界限不清晰，成團(tuán)塊狀生長)以及MTT試驗細(xì)胞活力檢測或者TUNEL凋亡測試就能對該藥物是否有神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行評估。

2.少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖試驗：如果要對藥物對少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行評估，可以通過細(xì)胞計數(shù)，或者通過ki-67或者Brdu染色對增殖細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記進(jìn)行計算[10]。結(jié)合以上OPCs體外缺血模型能夠用來評估哪些因子能直接妨礙OPCs存活或者抑制其增殖，因此可以基于這些因子進(jìn)而篩選出模擬缺血缺氧條件下對少突膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用的藥物。另外，還可以進(jìn)一步闡明缺血缺氧條件下OPCs死亡的分子機(jī)制。

二、OPCs遷移試驗

1.Transwell試驗:Transwell是一種上室可分離的雙層培養(yǎng)板，中間以聚碳酸酯膜相隔。方法如下：試驗時將OPCs以5×104個細(xì)胞(分布在50μl DMEM以及0.5% FBS培養(yǎng)液中)的密度種植在上邊小室中，下面小室中添加同樣培養(yǎng)液[11]。Transwell試驗有兩種模式，分別可以考察藥物或者因子對細(xì)胞的趨化性/趨藥性以及趨動性。僅在下室添加藥物考察趨藥性(上下室藥物濃度不同)，而趨動性為上下室都添加相同濃度的藥物。趨藥性表明對細(xì)胞的直接吸引力/排斥力，而趨動性表明藥物對細(xì)胞的隨機(jī)運動水平的作用。最后對穿過聚碳酸酯膜進(jìn)入到下室的細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行固定，染色然后拍照統(tǒng)計，就可以判定該藥物對OPCs遷移作用。作為最常見的體外遷移試驗，這種方法有諸多優(yōu)點。首先，試驗周期短，試驗結(jié)果明顯。其次，由于Transwell小室中需要加的液體量相對較小，因此同其他遷移試驗相比生長因子或者拮抗劑等藥物需要添加的量少。另外，雖然最終結(jié)果是以清點遷移后的細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)，屬于勞動密集型的方法，但卻相對客觀、準(zhǔn)確。但這個方法也有一個缺點，即需要大量的細(xì)胞，而且Transwell小室的只能一次使用，不能循環(huán)利用，且價格不便宜。

2.瓊脂糖遷移試驗:瓊脂糖遷移試驗是將分離后的的OPCs以5×107個細(xì)胞/毫升的密度重懸于SATO培養(yǎng)液中(添加10%FBS以及0.3%低熔點瓊脂糖)，繼續(xù)放在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(防止此時瓊脂糖硬化)[12]。取1.5μl上述重懸液于24孔板中央，緊接著將培養(yǎng)板放在4℃冰箱中15min用于硬化瓊脂糖。冷卻后，在瓊脂糖液滴周圍添加50μl SATO培養(yǎng)液，2h后繼續(xù)沿著孔壁添加450μl SATO培養(yǎng)液，此時或24h后可在SATO培養(yǎng)液中添加待測試的藥物或因子。之后的1～6天，每天記錄遷移出瓊脂糖液滴的OPCs離液滴最遠(yuǎn)的距離。距離越遠(yuǎn)表示遷移能力越強(qiáng)。因為該遷移試驗持續(xù)時間長，必須在SATO培養(yǎng)液中添加抑制OPCs增殖的阿非迪霉素(aphidicolin)用于排除OPCs增殖可能對其遷移結(jié)果的影響。

首先，這個試驗?zāi)茉诟嗟臅r間點來評價細(xì)胞遷移的程度。其次，在試驗開始以后能夠通過添加或者撤銷拮抗劑，實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。但是缺點在于試驗周期較長，并且試驗過程中，少突膠質(zhì)細(xì)胞能合成、分泌其他能影響遷移的因子，干擾試驗。

3.劃痕試驗:劃痕試驗是在鋪滿單層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中人為地創(chuàng)造一條缺口，即“傷痕”[13]。接著缺口兩邊的細(xì)胞會移動，慢慢“愈合”這一“傷痕”。首先需要在培養(yǎng)皿中種上約能覆蓋培養(yǎng)皿70%～80%面積的細(xì)胞，用細(xì)胞刮刀在培養(yǎng)皿中間劃開一條細(xì)胞缺口。接著通過換液，懸浮的細(xì)胞會被清洗掉。然后用添加了待測藥物或因子的SATO培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)(不添加生長因子)。最后，24h或48h后，對越過缺口的OPCs數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。

劃痕試驗是分析細(xì)胞遷移試驗中最簡單，也是花費最少的方法。整個試驗所需的材料并無特殊，且實驗條件不苛刻，易改良。其次，還能觀察到少突膠質(zhì)細(xì)胞遷移中的形態(tài)。但是不像Transwell試驗，劃痕試驗中不能制造化學(xué)梯度，因此不能檢測對某種因子或藥物的趨化性。而且劃痕試驗比較費時，首先需要10～15天來種植細(xì)胞到培養(yǎng)皿以及劃痕，之后還需要1～2天來觀察劃痕后的遷移結(jié)果。最后一個缺點是由于試驗在培養(yǎng)皿中進(jìn)行，因此需要大量的細(xì)胞以及試驗藥物。

三、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化模型

1.少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng):少突膠質(zhì)細(xì)胞分化培養(yǎng)是在OPCs培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的實驗[14]。純化后的OPCs以2.5×104個細(xì)胞/平方厘米接種在培養(yǎng)板上(此時培養(yǎng)液為SATO，添加1%青霉素/鏈霉素，1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑以及0.5% FBS, 10ng/ml PDGF-AA 以及10ng/ml FGF-2)。添加PDGF-AA和FGF-2是為了促進(jìn)OPCs的黏附、生存以及增殖。以O(shè)PCs培養(yǎng)液培養(yǎng)1天后，將原培養(yǎng)液中的PDGF-AA以及FGF-2換成3%FBS后隨即進(jìn)入分化培養(yǎng)實驗。培養(yǎng)7天后，培養(yǎng)的細(xì)胞就是以成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞為主的細(xì)胞，即80%以上細(xì)胞表達(dá)髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)，少部分細(xì)胞表達(dá)NG2。

2.少突膠質(zhì)細(xì)胞分化形態(tài)分析:這是評價增殖階段或者分化階段添加的藥物或因子能否對少突膠質(zhì)細(xì)胞分化過程起抑制作用的重要步驟。可以通過分別計算OPCs細(xì)胞數(shù)(NG2陽性)以及成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)(MBP陽性)的變化來說明藥物對OPCs分化的作用，如果抑制分化，應(yīng)表現(xiàn)為OPCs細(xì)胞數(shù)增多，成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞減少或不變[15]。另外，由于少突膠質(zhì)細(xì)胞分化過程中，形態(tài)會逐漸變化。因此在MBP陽性細(xì)胞中，針對其形態(tài)不同分為簡單分枝的少突膠質(zhì)細(xì)胞，復(fù)雜分枝的少突膠質(zhì)細(xì)胞以及部分形成膜結(jié)構(gòu)的少突膠質(zhì)細(xì)胞。而對此進(jìn)行的分類統(tǒng)計可以從形態(tài)上直接說明OPCs分化過程是否受到影響。也可以通過Image J軟件進(jìn)行單個MBP陽性細(xì)胞的細(xì)胞直徑以及分枝復(fù)雜程度的評判，最終結(jié)果以單位直徑的分枝數(shù)計算，但是最少需要統(tǒng)計50個細(xì)胞。

四、少突膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元共培養(yǎng)體系

脊髓背角神經(jīng)元(dorsal root ganglion, DRG)與少突膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)[16]。首先需要培養(yǎng)DRG神經(jīng)元：DRG神經(jīng)元由孕期15天大鼠中獲取，并在37℃下用木瓜蛋白酶，1-半胱氨酸和DNA酶解離60min。解離后，加入含有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基以終止酶作用，離心5min收集細(xì)胞。最后，將150μl密度為1.5×105個細(xì)胞的細(xì)胞懸液涂布在涂有多聚賴氨酸和生長因子減少的基質(zhì)膠的蓋玻片上，并在補(bǔ)充有10%FBS的DMEM(含1%青霉素/鏈霉素和100ng/ml神經(jīng)生長因子)中培養(yǎng)21天。為了去除污染細(xì)胞，在接種后在1、4和7天用5-氟-2′-脫氧尿苷將培養(yǎng)物脈沖3次，持續(xù)48h。培養(yǎng)基每2天更換1次，21天后培養(yǎng)基更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。然后，按上述方法分離培養(yǎng)OPCs。最后，將純化的OPCs以每個蓋玻片7.5×104的密度接種到神經(jīng)元上。共培養(yǎng)物保持15天，培養(yǎng)基每2～3天更換一次。髓鞘形成開始于共培養(yǎng)后的第6天，并且可以觀察到在第9天附近形成第一髓鞘。在14天大多數(shù)OPCs已經(jīng)分化為成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞并且發(fā)生了廣泛的髓鞘形成。神經(jīng)突密度與形成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞百分比之間的關(guān)系為髓鞘分析提供了堅實的基礎(chǔ)。共培養(yǎng)體系的優(yōu)點是能保持少突膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元相互作用的生理相關(guān)性并維持體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的便利性，且這種培養(yǎng)體系可以研究髓鞘形成而沒有其他類型神經(jīng)細(xì)胞的混淆效應(yīng)。

五、小腦切片培養(yǎng)

盡管體外細(xì)胞培養(yǎng)是非常有用且易于獲得的模型，但它們的主要缺點在于生長在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板上，而在于喪失了三維結(jié)構(gòu)。因此，利用上述體外模型，不可能維持正常結(jié)構(gòu)以及腦組織中存在的所有細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。為了克服這個問題，有人使用離體腦切片培養(yǎng)研究不同的神經(jīng)生物學(xué)過程，這樣可以保留支持所有組織回路和相互作用的三維建筑組織。切250～400μm的厚腦片，置于半乳膠膜上生長，并保持氣-液界面，這導(dǎo)致更少更薄的組織并且維護(hù)和處理更為簡單。當(dāng)主要目標(biāo)是評估髓鞘形成的變化時，通常使用器官型小腦切片培養(yǎng)物，可以在視覺限定的區(qū)域中評估少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟過程和髓鞘形成過程。事實上，小腦中的髓鞘形成發(fā)生在出生后，來自早期出生后動物的小腦切片培養(yǎng)物復(fù)制了體內(nèi)髓鞘形成過程[11]。此外，小腦是特定區(qū)域哺乳動物大腦中最大的纖維束，即白質(zhì)束，這使得它成為評估髓鞘形成有利和實用的模型。

六、展 望

用于評估少突膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷、再生的體外模型盡管由于缺乏腦回路以及缺乏系統(tǒng)循環(huán)和完整的體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而受到限制，但仍然是用于評估化合物/藥物的細(xì)胞毒性或治療功效的相對簡單且有用的工具。因為體外模型能直接鑒定不同損傷或疾病的靶點的同時，在相同培養(yǎng)條件下對針對該新靶點藥物的效果進(jìn)行直接測定，因而能節(jié)約體內(nèi)實驗中使用的動物數(shù)量，縮短研究周期。另外，體外模型更能聚焦少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷或再生的不同階段進(jìn)行研究，排除整體動物實驗因無法剝離損傷與再生的各個階段的干擾。而在與神經(jīng)元細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)或者小腦切片模型中，一定程度上可以囊括其他細(xì)胞對少突膠質(zhì)細(xì)胞的影響，因而能在某種程度上降低非整體研究的局限性。