趙紅宇 李亞山 朱為梅 吳 菲 李德旋 周 盛 楊紅玲

慢性鉛中毒是由于鉛的累計(jì)吸收(人體每日鉛吸收量超過(guò)0.5mg可發(fā)生蓄積作用，當(dāng)血鉛含量超過(guò)50μg/dl可判斷為慢性鉛中毒)而導(dǎo)致的非傳染性疾病[1]。有研究顯示隨著我國(guó)工業(yè)化發(fā)展和日常含鉛產(chǎn)品增多，慢性鉛中毒發(fā)生率逐年升高，且呈個(gè)別地區(qū)集中性[2]。鉛在攝入后主要與血漿蛋白結(jié)合，而血漿蛋白可借助于血液流動(dòng)分布全身，數(shù)周后約有95%以磷酸鉛成分沉積于骨骼和毛發(fā)。其余5%則分布于軟組織如肝臟、脾臟、腎臟、腦等。近年來(lái)鉛中毒受到眾多學(xué)者的關(guān)注，包括肝、腎以及神經(jīng)系統(tǒng)均有文獻(xiàn)報(bào)道[3,4]。2016年本研究組在云南某地進(jìn)行鉛中毒流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鉛中毒地區(qū)心力衰竭發(fā)生率是正常人群的2.3倍，因此筆者推測(cè)鉛中毒可能對(duì)心肌有一定損害。目前關(guān)于鉛中毒損傷心肌的報(bào)道主要見于急性鉛中毒，慢性較少，因此本研究探討慢性鉛中毒對(duì)心肌的影響，以進(jìn)一步明確鉛中毒對(duì)心肌的損害作用，為今后臨床中治療慢性鉛中毒提供參考。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性SD(Sprague Dawley)大鼠40只，體質(zhì)量160～180g，購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)2011-004。所有大鼠在購(gòu)買后均飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樓，飼養(yǎng)間為無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)，日常溫度22～26℃，濕度40%～60%，光照和黑暗=12h/12h。(2)實(shí)驗(yàn)試劑：醋酸鉛購(gòu)于吳江市奧邦精細(xì)化工有限公司；白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒購(gòu)于上海嵐派生物科技有限公司；血鉛和心鉛試劑盒購(gòu)于成都安普諾生物科技有限公司；肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)以及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購(gòu)于南京森貝伽生物科技有限公司；多克隆兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase-8，caspase-8)抗體和單克隆兔抗β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；二抗購(gòu)于上海華壹生物科技有限公司；TRizol RNA、Taq polymerase以及DNA marker提取試劑盒購(gòu)于寧波有成生物醫(yī)藥科技有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于美國(guó)Promega公司；PCR引物購(gòu)于上海生物生工公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法：(1) 動(dòng)物分組：適應(yīng)性喂養(yǎng)期結(jié)束后，所有大鼠均采用尾靜脈取血法收集血液，檢測(cè)心功能指標(biāo)CK、CK-MB和LDH(經(jīng)檢驗(yàn)所有指標(biāo)均在正常范圍內(nèi))。后采用數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、低劑量鉛中毒組、中劑量鉛中毒組和高劑量鉛中毒組，每組10只。(2) 造模方法：正常組大鼠給予0g/L醋酸鉛水溶液，低劑量鉛中毒組給予0.5g/L醋酸鉛水溶液，中劑量鉛中毒組給予1g/L醋酸鉛水溶液，高劑量鉛中毒組給予2g/L醋酸鉛水溶液，連續(xù)給予1個(gè)月(給藥劑量根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道確定)。(3) 血液和組織收集方法：1個(gè)月后隔夜禁食不禁水12h處死大鼠。處死大鼠采用3ml 1%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后固定于解剖板，腹主動(dòng)脈取血法收集血液，后統(tǒng)一離心并收集上清分裝于1.5ml的離心管中保存?zhèn)溆?，血液收集后取出心臟，切取約1/4置于4%多聚甲醛溶液中保存用于病理學(xué)檢測(cè)，其余保存于超低溫冰箱備用。(4) 生化指標(biāo)的檢測(cè)：血鉛、心鉛、心功能指標(biāo)CK、CK-MB和LDH、炎性因子指標(biāo)IL-6、IL-8和TNF-α的測(cè)定均根據(jù)試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行。(5) 心肌組織蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色：HE染色操作參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行，具體為從多聚甲醛溶液中取出心臟組織，自來(lái)水沖洗24h后，常規(guī)石蠟包埋和染色，切片機(jī)切片后二甲苯脫蠟、梯度乙醇和超純水依次清洗、HE染色、二甲苯透明封片即完成。(6)蛋白表達(dá)：待檢測(cè)蛋白caspase-3以及caspase-8采用蛋白印跡法(Western blot法)，稱取心肌組織1g用組織蛋白裂解液裂解后提取上清，定量調(diào)平，然后每組各取50μg行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)凝膠電泳，電泳完成后半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，洗滌3次后5%脫脂牛奶封閉2h，取出后加入1抗封閉過(guò)夜，次日取出加入2抗孵育1h，洗滌3次后暗室曝光洗片，掃描儀掃描后計(jì)算各條帶灰度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(7) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：待檢測(cè)caspase-3和caspase-8的mRNA檢測(cè)方法采用RT-qPCR法，從超低溫冰箱中取出心臟組織，稱取20mg用總RNA提取試劑盒提取總RNA，定量、反轉(zhuǎn)錄完成后，每組各取2μg行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性10s、58℃退火30s、72℃延伸35s、循環(huán)次數(shù)40次，最后72℃延伸5min，完成后采用2-ΔΔCT法統(tǒng)計(jì)分析，引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物序列設(shè)計(jì)表

結(jié) 果

1.大鼠一般情況：4組大鼠均無(wú)死亡，此外各組大鼠在飲食量上也沒(méi)有差異，但鉛中毒3個(gè)劑量組相較于模型組精神活動(dòng)量有一定降低。

2.血鉛和心鉛含量比較：與正常組比較，低劑量、中劑量和高劑量鉛中毒組血鉛和心鉛均明顯升高(P<0.05)。與低劑量鉛中毒組比較，中劑量和高劑量鉛中毒組血鉛和心鉛也明顯升高(P<0.05)。此外高劑量鉛中毒組血鉛和心鉛也明顯高于中劑量鉛中毒組(P<0.05)，詳見表2。

表2 各組大鼠血鉛和心鉛含量比較

3.心功能指標(biāo)比較：各組大鼠心功能血清學(xué)指標(biāo)CK、CK-MB和LDH與正常組比較，低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高劑量鉛中毒組則明顯升高(P<0.05)。此外高劑量鉛中毒組也明顯高于低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組(P<0.05)，詳見表3。

表3 各組大鼠心功能比較

4.炎性因子指標(biāo)比較：各組大鼠血清炎性因子指標(biāo)TNF-α、IL-6和IL-8與正常組比較，低劑量、中劑量和高劑量鉛中毒組明顯升高(P<0.05)。此外高劑量鉛中毒組TNF-α、IL-6和IL-8明顯高于低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組(P<0.05)，詳見表4。

表4 各組大鼠炎性因子比較

5.HE染色：正常組大鼠心肌纖維排列整齊、表面光滑，低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組有一定心肌纖維排列紊亂，但和正常組差異并不明顯，而高劑量鉛中毒組則出現(xiàn)明顯心肌肥大、纖維排列無(wú)序和細(xì)胞界限不清晰，詳見圖1。

6.實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果：與正常組比較，低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組心肌組織caspase-3與caspase-8 mRNA表達(dá)沒(méi)有差異，而高劑量鉛中毒組則明顯升高(P<0.05)。此外高劑量鉛中毒組也明顯高于低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組(P<0.05)，詳見圖2。

7.蛋白表達(dá)結(jié)果：與正常組比較，低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組心肌組織中caspase-3與caspase-8蛋白差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高劑量鉛中毒組則明顯升高(P<0.05)。此外高劑量鉛中毒組也明顯高于低劑量鉛中毒組和中劑量鉛中毒組(P<0.05)，詳見圖3。

圖1 大鼠心肌組織HE染色(×400)A.正常組;B.低劑量鉛中毒組；C.中劑量鉛中毒組;D.高劑量鉛中毒組

圖2 各組大鼠心肌組織中caspase-3和caspase-8的mRNA擴(kuò)增特點(diǎn)A.正常組;B.低劑量鉛中毒組;C.中劑量鉛中毒組;D.高劑量鉛中毒組；正常組比較，*P<0.05；與低劑量鉛中毒組比較，#P<0.05；與中劑量鉛中毒組比較，ΔP<0.05

圖3 各組大鼠心肌組織中caspase-3和caspase-8的相對(duì)表達(dá)A.正常組;B.低劑量鉛中毒組;C.中劑量鉛中毒組;D.高劑量鉛中毒組；與正常組比較，*P<0.05；與低劑量鉛中毒組比較，#P<0.05；與中劑量鉛中毒組比較，ΔP<0.05

討 論

鉛中毒引起心肌損傷已得到大量臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)[7～10]。Chyeny等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鉛中毒人群相較于正常人群暫時(shí)性以及永久性心功能損害率均明顯升高。劉穎等[12]以昆明市東川區(qū)某中型銅冶煉生產(chǎn)企業(yè)448例鉛作業(yè)工人為考察對(duì)象，比較了心功能多項(xiàng)指標(biāo)的變化特點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鉛工作人員有明顯心電圖異常，心肌酶譜關(guān)鍵酶類CK-MB明顯升高，且升高趨勢(shì)與血鉛濃度明顯相關(guān)，工作人員接受驅(qū)鉛治療后，CK-MB則明顯下降。此外還有很多類似的研究[13～15]。毫無(wú)疑問(wèn)，上述研究均證實(shí)，鉛中毒對(duì)心肌確有一定損害作用，這與本研究結(jié)論也是一致的。本研究采用不同劑量的醋酸鉛構(gòu)建慢性鉛中毒大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，大鼠日常自由飲用2g/L醋酸鉛水溶液1個(gè)月，可有明顯心肌代謝酶異常，主要表現(xiàn)為CK、CK-MB和LDH的升高。同時(shí)在研究中檢測(cè)了炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8的含量，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，低劑量、中劑量和高劑量鉛中毒組TNF-α、IL-6和IL-8均明顯升高，其與心功能的改變并不一致，分析原因可能是鉛中毒早期就可能存在炎性反應(yīng)的發(fā)生，只有達(dá)到一定閾值，才會(huì)引起心肌酶代謝譜的異常。

關(guān)于鉛中毒引起心肌損害的主要原因：①腦皮質(zhì)-心臟系統(tǒng)，部分研究者認(rèn)為鉛中毒對(duì)心功能的損害是通過(guò)腦皮質(zhì)-心臟系統(tǒng)作用的，鉛中毒后腦是首要損害器官之一，當(dāng)腦中有大量鉛沉積時(shí)，可引起大腦皮質(zhì)興奮與抑制功能紊亂，進(jìn)而使神經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，最終導(dǎo)致皮質(zhì)-心臟調(diào)節(jié)障礙；②直接損害心肌，鉛可直接作用心肌細(xì)胞，通過(guò)抑制心肌收縮和傳導(dǎo)，進(jìn)而誘發(fā)心肌細(xì)胞對(duì)外界刺激興奮性異常，同時(shí)造成心臟自主神經(jīng)紊亂，最終導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈灌注不足；③損害陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶系統(tǒng)，血鉛可影響心肌微粒體中的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶，而陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶與鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)異常最直接后果為心肌細(xì)胞功能紊亂[16～18]。但是總結(jié)上述成果，相關(guān)研究并沒(méi)有涉及對(duì)心肌本身?yè)p害的研究。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自主死亡現(xiàn)象，也是所有細(xì)胞的最終結(jié)局[19]。一般而言，細(xì)胞凋亡是正常的，但在病理情況下，如受到外界有害因子的刺激，其凋亡會(huì)加速發(fā)生[20]。由于心肌細(xì)胞具有不可再生性，因此當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生后，可能會(huì)帶來(lái)心肌部分功能的永久喪失[21]。在凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白中，caspase家族是核心之一，研究發(fā)現(xiàn),caspase家族蛋白參與心肌細(xì)胞凋亡主要為caspase-8和caspase-3蛋白，其中caspase-8位于凋亡級(jí)聯(lián)通路的上游，本身并不會(huì)促進(jìn)凋亡，但可刺激下游caspase-3、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bcl-2 associated x protein, Bax)發(fā)揮作用，最終引起凋亡發(fā)生[22～24]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，低劑量和中劑量鉛中毒組心肌組織中caspase-8和caspase-3并沒(méi)有明顯升高，而高劑量組則明顯升高，分析原因，可能是大鼠對(duì)鉛有一定的代謝能力，當(dāng)在可控濃度范圍內(nèi)是不會(huì)對(duì)心肌造成損害的，而當(dāng)其超出心肌可承受范圍，則會(huì)造成心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，給予大鼠2g/L醋酸鉛水溶液自由飲用1個(gè)月，可引起其心肌酶譜的異常，其機(jī)制可能是鉛攝入引起心肌caspase-8和caspase-3表達(dá)升高作用的。但本研究也有一定的局限性，這主要是因?yàn)槁糟U中毒是一個(gè)緩慢的過(guò)程，在其進(jìn)展中可能涉及多種信號(hào)通路調(diào)控，具體為哪條信號(hào)通路調(diào)節(jié)作用的仍需進(jìn)一步明確。