林詩惠綜述 歐維琳審校

肺炎支原體(MP)是引起呼吸道感染的常見病原，3～15歲兒童的社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)中8%～40%由MP感染引起，MP呼吸道感染臨床表現(xiàn)呈多樣性，可以從無癥狀到鼻咽炎、鼻竇炎、中耳炎、咽扁桃體炎、氣管支氣管炎、細(xì)支氣管炎和肺炎等。喘息是MP所致細(xì)支氣管炎的主要表現(xiàn)，嬰幼兒支原體肺炎(MPP)者喘息癥狀較年長兒明顯。MP 感染還與哮喘樣急性發(fā)作相關(guān)，有31%～50%MP感染者會出現(xiàn)哮喘樣急性發(fā)作[1]。MP感染的致病機(jī)制尚未完全明確，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MP的P1和P30黏附蛋白具有直接細(xì)胞毒性反應(yīng)，內(nèi)源性活性氧及過氧化物、脂蛋白也是重要毒力因素。近年來研究發(fā)現(xiàn)，社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(CARDS TX)是MP表達(dá)的一種新型毒力蛋白，在MP致病機(jī)制中發(fā)揮著主要作用，本文從CARDS TX的結(jié)構(gòu)功能、致病機(jī)制方面與MP感染相關(guān)性喘息研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CARDS TX概述

2005年kannan等[2]在研究各種宿主蛋白作為支原體表面寄生的靶點(diǎn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種名為MPN372的支原體多肽，它具有ADP-核糖體化(ADP-ribosyltransferase，ADP-RT)和空泡化活性，并將其命名為CARDS TX。它可以與肺表面活性劑的主要成分表面活性蛋白A(SP-A)和膜聯(lián)蛋白家族成員中的AnxA2(Annexin A2)結(jié)合，并利用網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)行內(nèi)化，發(fā)揮一系列的細(xì)胞毒性作用。

2 CARDS TX的結(jié)構(gòu)功能

2.1 CARDS TX的分子結(jié)構(gòu) CARDS TX 由17個α螺旋和43條β鏈組成，具有功能上可分離的N-末端和C-末端結(jié)構(gòu)域。N-末端的D1結(jié)構(gòu)域(D1)和C-末端的D2、D3結(jié)構(gòu)域(D2、D3)折疊成等腰三角形排列。

2.1.1 CARDS TX的N-末端結(jié)構(gòu)域：CARDS TX 的N-末端為單抗ADP核糖轉(zhuǎn)移酶(mono-ADP ribosyltransferase，mART)，具有與NAD結(jié)合能力和ADP-RT活性。研究發(fā)現(xiàn)[3]，CARDS TX通過與NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)炎性反應(yīng)體共定位，并催化NLRP3的ADP-核糖化來激活NLRP3炎性反應(yīng)體，釋放IL-1β。IL-1β決定了一系列炎性相關(guān)疾病炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度，還可加重變態(tài)反應(yīng)性疾病，如過敏性哮喘[4-5]。載脂蛋白E(ApoE)通路可通過抑制NLRP3炎性小體的激活和氧化應(yīng)激而負(fù)向調(diào)節(jié)過敏性氣道炎性反應(yīng)，靶向ApoE通路可能是治療哮喘等過敏性氣道疾病的新途徑[6]。CARDS TX與N端肽結(jié)合可產(chǎn)生功能性IgE誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，引發(fā)哮喘樣疾病[7]。

2.1.2 CARDS TX的C-末端結(jié)構(gòu)域：CARDS TX C-末端的β-三葉結(jié)構(gòu)域與CARDS TX的細(xì)胞表面受體識別、結(jié)合及內(nèi)化有關(guān)，并且C-末端區(qū)域以類似全長毒素的方式誘導(dǎo)空泡化。研究數(shù)據(jù)表明[8]，CARDS TX與磷脂酰膽堿(PC)和鞘磷脂(SM)的結(jié)合能力高于其他膜脂，將C-末端的20個殘基截?cái)嗪蟀l(fā)現(xiàn)，這種特異性結(jié)合功能消失，這說明受體的結(jié)合部位位于D3。C末端除了具有致細(xì)胞空泡化、ART活性的必要結(jié)構(gòu)，還具有多個抗原表位，使CARDS TX具有較強(qiáng)的免疫原性。

2.2 CARDS TX的氨基酸結(jié)構(gòu) CARDS TX是一種由591個氨基酸組成的毒力因子，與百日咳毒素(PT)的S1亞基(PT-S1)和霍亂毒素(CT)的催化結(jié)構(gòu)域有同源性。這3種毒素的mART結(jié)構(gòu)域都具有DT亞組(CTxg)ADP核糖基化毒素的特征性R-STS/T-E信號基序。N-末端的精氨酸(R10)和中間區(qū)絲氨酸—蘇氨酸—絲氨酸(S49-T50-S51)氨基酸序列與NAD+定向結(jié)合，而催化性谷氨酸(E132)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移酶活性。但CARDS TX ADP-RT序列卻不同于其他細(xì)菌的mART結(jié)構(gòu)域，94-126殘基形成螺旋鏈構(gòu)成D1。因此，CARDS TX除了具有ADP-RT活性外，還可誘導(dǎo)細(xì)胞空泡化、黏膜細(xì)胞脫落和纖毛喪失。野生型(WT)和半胱氨酸到絲氨酸突變型CARD毒素的硫醇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸氨基末端殘基C230和C247形成了二硫鍵(DT)，DT對CARDS TX的構(gòu)象穩(wěn)定性和功能活性的保存至關(guān)重要[9]。

3 CARDS TX的致病機(jī)制

3.1 參與細(xì)胞膜表面黏附 細(xì)胞黏附是MP定植的關(guān)鍵步驟。CARDS TX可以與SP-A和AnxA2結(jié)合，使MP黏附于宿主細(xì)胞。在同時(shí)表達(dá)AnxA2和SP-A的NCI-h441細(xì)胞轉(zhuǎn)染AnxA2 siRNA后，AnxA2和SP-A的表達(dá)明顯減少，并且發(fā)現(xiàn)CARDS TX的結(jié)合能力及細(xì)胞空泡化作用與AnxA2及SP-A的表達(dá)呈正相關(guān)。研究表明，SP-A比AnxA2的表達(dá)更占優(yōu)勢，SP-A更易于作為結(jié)合靶標(biāo)。但AnxA2作為CARDS TX結(jié)合和內(nèi)化的獨(dú)特受體，CARDS TX可選擇性地與AnxA2結(jié)合，并在內(nèi)吞和轉(zhuǎn)移的早期階段調(diào)節(jié)膜動力學(xué)，增強(qiáng)CARDS TX的空泡化作用，且AnxA2抑制劑可阻斷此過程。MP感染后寄生在呼吸道黏膜表面，并繁殖于黏膜細(xì)胞，可釋放過氧化氫和核酸酶等物質(zhì)，誘導(dǎo)纖毛退化及葡萄糖代謝、氨基酸攝取和蛋白質(zhì)合成的生化損傷，造成呼吸道上皮細(xì)胞壞死、病變等[10]。此外，P1黏附素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附在MP中具有獨(dú)特性[11]。

3.2 內(nèi)化至細(xì)胞內(nèi) CARDS TX必須與宿主受體細(xì)胞AnxA2和SP-A受體結(jié)合后，利用網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)途徑內(nèi)化，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮ADP-RT和空泡化活性。其內(nèi)化方式與白喉毒素(diphtheria toxin，DT)類似，毒素被翻譯成一個單一的多肽鏈，通過網(wǎng)格蛋白途徑被內(nèi)吞。CARDS TX在內(nèi)化作用時(shí)可產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致細(xì)胞損傷和結(jié)構(gòu)惡化。

3.3 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸 CARDS TX從早期內(nèi)涵體運(yùn)輸?shù)酵砥趦?nèi)涵體，然后利用其獨(dú)特的KELED序列通過逆向運(yùn)輸(高爾基體中間室到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng))以發(fā)揮毒素的致病作用。CARDS TX的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)對NLRP3 ADP-RT介導(dǎo)的IL-1β分泌及誘導(dǎo)之后的液泡形成至關(guān)重要。KELED序列位于D1和D2、D3結(jié)構(gòu)域之間的接頭處。研究發(fā)現(xiàn)[8]，D1與D2、D3之間主要是極性連接，表明該界面可以被破壞，這能否成為靶向治療位點(diǎn)有待研究。

3.4 誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)空泡化 CARDS TX誘導(dǎo)的特征性空泡化可導(dǎo)致纖毛運(yùn)動減退和呼吸道上皮細(xì)胞完整性喪失，引起細(xì)胞死亡。CARDS TX誘導(dǎo)形成的泡液與幽門螺旋桿菌Vac A均呈酸性，但Vac A需要在酸性或弱堿存在下才能誘導(dǎo)酸性空泡形成[12]，CARDS TX則不需要。研究還發(fā)現(xiàn)，CARDS TX的泡液來源于晚期內(nèi)涵體，通過GTP結(jié)合蛋白Rab9(Rab9 GTPases)介導(dǎo)內(nèi)吞途徑實(shí)現(xiàn)空泡化作用。液泡ATP合成酶(V-ATPase)抑制劑bafilomycin A1和離子載體monensin可通過阻止早期內(nèi)涵體的內(nèi)吞途徑抑制液泡的形成。AnxA2不僅介導(dǎo)CARDS TX結(jié)合，而且還作為CARDS TX ADP核糖化和空泡化事件的關(guān)鍵介質(zhì)。纖溶酶是一種具有促炎活性的蛋白酶，氣道平滑肌(ASM)細(xì)胞可將纖溶酶原裂解成纖溶酶。纖溶酶原以AnxA2調(diào)節(jié)的方式刺激ASM細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在哮喘病理生理學(xué)中具有重要意義，靶向AnxA2介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能為治療慢性哮喘等疾病的氣道炎性反應(yīng)提供一種新的治療方法。

4 CARDS TX與MP感染喘息的關(guān)系

氣道炎性反應(yīng)是喘息性疾病發(fā)生的本質(zhì)，而過度炎性反應(yīng)是MP所致兒童呼吸道感染的病理生理基礎(chǔ)。與SP-4肉湯培養(yǎng)相比，CARDS TX mRNA的表達(dá)量在哺乳動物中明顯增高。CARDS TX可以解釋MP感染相關(guān)的細(xì)胞病理學(xué)和炎性反應(yīng)[13]，并且與MP感染喘息的發(fā)病、發(fā)展及喘息持續(xù)狀態(tài)存在關(guān)系。

4.1 CARDS TX與MP感染喘息的發(fā)病相關(guān) MP是嬰幼兒喘息最常見的病原體之一，初發(fā)喘息和反復(fù)喘息的患兒MP感染率和血清IgE水平均顯著高于非喘息患兒[14]，這表明MP感染與嬰幼兒喘息密切相關(guān)。Medina等[7]發(fā)現(xiàn)，CARDS TX足以在BALB/CJ小鼠中誘導(dǎo)哮喘樣疾病，其發(fā)病機(jī)制是CARDS TX通過Balb/C信號通路產(chǎn)生IgE，發(fā)生肥大細(xì)胞脫顆粒，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性。Ye等[15]研究認(rèn)為，產(chǎn)生這種過敏原特異性IgE是MP的黏附素P1蛋白，P1特異性IgE陽性的MP肺炎患者體內(nèi)表現(xiàn)為IL-4、IL-13、CCL17和CCL22的表達(dá)增加，Th0細(xì)胞過度分化為Th2細(xì)胞。這表明針對蛋白質(zhì)的抗體對宿主防御肺炎支原體很重要，也對靶向疫苗的開發(fā)具有重要的作用[16]?？傊珻ARDS TX在體內(nèi)具有高免疫原性表位，可引起嗜酸性粒細(xì)胞增多，T細(xì)胞和B細(xì)胞積聚，產(chǎn)生相應(yīng)的自身抗體，同時(shí)釋放各種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ (IFN-γ) 及多種白介素(IL)，包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IL-17等細(xì)胞因子[17-18],對T細(xì)胞亞群Th1/Th2比例產(chǎn)生破壞，表現(xiàn)為Th2細(xì)胞炎性反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致黏液化生和氣道高反應(yīng)性增加，肺功能下降，以氣道阻力增加和肺順應(yīng)性降低為特征。

4.2 CARDS TX與MP感染喘息的加重相關(guān) 有學(xué)者用CARDS TX抗原捕獲PCR和P1黏附素PCR反應(yīng)來檢測MP，以評價(jià)哮喘患兒體內(nèi)MP的抗體反應(yīng)及對哮喘控制情況的影響。研究發(fā)現(xiàn)，MP的檢出率與哮喘病情加重有關(guān)，并且推測，這可能與哮喘患兒對MP的體液免疫應(yīng)答較差有關(guān)，導(dǎo)致急性哮喘患兒有較高的MP感染率[19-20]。持續(xù)MP感染可產(chǎn)生大量CRP、乳酸脫氫酶(LDH)、鐵蛋白等炎性標(biāo)志物，可加重喘息性疾病，且CRP、LDH和黏液栓的存在，與難治性MPP患兒胸片浸潤影的消失時(shí)間有關(guān)[21-22]。氣道內(nèi)MP水平較高時(shí)(MP高負(fù)荷)，其患兒的肺外表現(xiàn)、肺實(shí)變、胸腔積液及過敏史、空氣變應(yīng)原試驗(yàn)陽性、血清IgE、ECP升高的比例均明顯升高，表現(xiàn)為肺泡灌洗液(BALF)中IL-4水平明顯升高[23]。一項(xiàng)對Th17與MPP關(guān)系的研究得出，過度的Th17細(xì)胞反應(yīng)可能是持續(xù)感染期間免疫病理損傷的原因，miR-29c/B7-H3/Th17軸在MPP患兒過度炎性反應(yīng)中起重要作用[24]。哮喘患兒病情加重與IgM水平直接相關(guān)，有MP抗體IgM陽性的哮喘患者顯著增加了1年再入院的機(jī)會，并且CARDS TX IgM 向IgG的轉(zhuǎn)換過程中，不僅加強(qiáng)了CARDS TX在氣道感染期間的合成和檢測，而且提高了CARDS TX引發(fā)強(qiáng)烈免疫原性反應(yīng)的能力[25]。以上均可能是MP感染與喘息性疾病加重密切相關(guān)的原因。

4.3 CARDS TX與MP感染喘息持續(xù)狀態(tài)密切相關(guān) MP可以在呼吸道中存在較長時(shí)間，即使在使用適當(dāng)?shù)目股刂委熀?，MP仍會在呼吸道中持續(xù)數(shù)月并保持傳染性，這與發(fā)展為喘息持續(xù)狀態(tài)密切相關(guān)。單次暴露于CARDS TX足以在體內(nèi)引起長時(shí)間的過敏性炎性反應(yīng)，并且炎性峰值的時(shí)間與CD4+T細(xì)胞相關(guān)的肺順應(yīng)性下降程度有關(guān)聯(lián)，MP感染的哮喘患兒在穩(wěn)定期氣道T淋巴細(xì)胞免疫功能明顯下降，表現(xiàn)為CD4+/CD8+比值顯著降低，這可能與哮喘在MP感染后出現(xiàn)喘息持續(xù)狀態(tài)有關(guān)[26-27]。并且，低水平的MP無法有效地誘導(dǎo)PGE2而下調(diào)過敏反應(yīng)，從而維持甚至加重哮喘氣道的過敏性炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)[28-29]，MP可在病原體表面形成一層生物膜，隨著生物膜的成熟，CARDS TX水平下降，但耐藥性也隨之增加，更不容易被抗生素抑制和補(bǔ)體殺傷。在難治性哮喘患兒呼吸道分泌物能檢測到CARDS TX，相對于CARDS TX陰性的患兒疾病難以控制，生活質(zhì)量較差。此外，TNF-α也與持續(xù)復(fù)發(fā)性喘息風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[30]。韓國一項(xiàng)觀察性研究發(fā)現(xiàn)[31]，只有一小部分患兒在MPP后出現(xiàn)反復(fù)喘息發(fā)作(RWE)，RWE患兒在初次MP感染時(shí)出現(xiàn)喘息的可能性更大，然而在MP肺炎流行期住院的RWE患兒并沒有增加，這是因?yàn)镸P再感染在兒童中很少見，包括反復(fù)喘息發(fā)作的患兒或哮喘患者。

綜上所述，CARDS TX作為MP的致病毒素，一方面通過ADP-RT活性來激活NLRP3炎性反應(yīng)體，引起一系列的炎性反應(yīng)；另一方面利用毒素的空泡化作用引起纖毛運(yùn)動減慢及呼吸道上皮細(xì)胞完整性的破壞，與喘息的發(fā)生、加重及持續(xù)狀態(tài)密切相關(guān)。對于結(jié)構(gòu)功能方面與MP感染的喘息研究較少，仍需進(jìn)一步研究，有望對MP感染伴喘息性疾病診治提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，對于MP感染相關(guān)性喘息的治療及研發(fā)CARDS TX的靶向藥物提供新的思路。