檀紅玲，梁丹，檀國軍，馬玉騰，韓梅，高夢穎，張軍立

多發(fā)性硬化是最為常見的一種中樞神經(jīng)脫髓鞘疾病，急性活動期中樞神經(jīng)白質(zhì)區(qū)可見大量炎性脫髓鞘斑，而陳舊病變因膠質(zhì)纖維增生而形成鈣化斑，以多發(fā)病灶、緩解—復(fù)發(fā)病程為特點(diǎn)[1]。α-硫辛酸(α-LA)是一種強(qiáng)效抗氧化劑，近年來，研究發(fā)現(xiàn)α-LA還具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[2-3]，但具體機(jī)制尚不完全清楚。核因子κB(NF-κB)是細(xì)胞中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB形成復(fù)合物存在于胞漿，經(jīng)感染、氧化應(yīng)激、脂多糖等刺激后可活化NF-κB產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，參與炎性反應(yīng)[4]。本研究旨在通過檢測脊髓中NF-κB及其抑制蛋白IκB的表達(dá)，進(jìn)一步探討α-LA對自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠的可能保護(hù)機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：成年雌性Wistar大鼠42只，體質(zhì)量180～200 g；豚鼠10只，體質(zhì)量400 g左右，雌雄不限；均購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SCXK(冀)2019-0102，實(shí)驗(yàn)動物于SPF級動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由攝食飲水。(2)試藥試劑：α-LA購自香港吉斯恩貝國際貿(mào)易有限公司，完全福氏佐劑、4%多聚甲醛、3%甲醇、雙氧水、枸櫞酸購自上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司，DAB顯色試劑盒、NF-κB、IκB抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，山羊血清封閉液、NF-κB、IκB一抗、生物素化二抗購自沈陽萬類生物科技有限公司，ELISA試劑盒[白介素(IL)-2、IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)]購自Cusabio公司。(3)儀器設(shè)備：BX51光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，5810離心機(jī)(德國艾本德公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2019年1—12月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 模型建立[5]：豚鼠麻醉狀態(tài)下，于背部切口取脊髓，小心剔除脊膜和血管，冰浴中將脊髓與生理鹽水充分混合制備為50 %(質(zhì)量/體積)脊髓生理鹽水勻漿(GPSCH)，再加入等體積完全福氏佐劑(CFA，含4 mg/ml卡介苗)制成油包水抗原乳劑，完全乳化的標(biāo)準(zhǔn)為取乳化劑滴入清水中不散開。將油包水抗原乳劑注入大鼠四足掌膠質(zhì)墊內(nèi)，每只0.4 ml，注射后按壓針眼以免乳化劑外漏，建立EAE動物模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：將成年健康雌性Wistar大鼠42只，隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組(NC組)6只，不予任何處理；36只大鼠用新鮮豚鼠GPSCH誘導(dǎo)免疫，待大鼠發(fā)病后隨機(jī)分為EAE組、α-LA組，每組18只。α-LA組于發(fā)病后每日腹腔注射α-LA 100 mg/kg ，1次/d，共注射7 d；EAE組和NC組則每日腹腔注射等體積的生理鹽水，共注射7 d。其中EAE組和α-LA組再按發(fā)病、緩解、復(fù)發(fā)3個時(shí)點(diǎn)即發(fā)病后0 d、、7 d、14 d，每個時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取6只大鼠觀察行為學(xué)及病理變化。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 神經(jīng)功能評分： 每日觀察大鼠體質(zhì)量及精神狀態(tài)、活動度等進(jìn)行神經(jīng)功能評分，采用國際通用的Kono評分標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中1分為大鼠尾部無力，2分為大鼠尾部無力+肢體無力，3分為大鼠肢體輕度麻痹，4分為大鼠肢體嚴(yán)重麻痹且被動翻身后不能復(fù)原，5分為大鼠處于瀕死狀態(tài)或死亡。

1.3.2 組織病理學(xué)觀察： 大鼠麻醉狀態(tài)下，快速取其脊髓腰膨大組織，4%多聚甲醛固定，制備成組織石蠟切片，行改良的三色染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)改變。

1.3.3 NF-κB、IκB檢測：制備6 μm的大鼠脊髓腰膨大組織橫截面切片，65℃烘烤脫蠟后水化，室溫下3%甲醇雙氧水孵育20～30 min；采用熱修復(fù)法，將切片置于適量枸櫞酸溶液中沸騰3～5 min；拿出切片放入冷水中冷卻，再在切片上滴加山羊血清封閉液，室溫下孵育20～30 min；然后在切片上滴加一抗，4℃孵育過夜；次日清洗后在切片上滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min；清洗后在切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min；按照DAB顯色試劑盒說明書，進(jìn)行DAB顯色；蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察NF-κB、IκB的表達(dá)情況。應(yīng)用漢化版Image-Pro Plus v 5.1軟件(美國Media Cybernetics)進(jìn)行圖像分析[7]，選取陽性表達(dá)最強(qiáng)的5個視野進(jìn)行計(jì)算，得出陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度，從而得出免疫組化評分(IHS)的數(shù)值。染色評分[8]：以陽性細(xì)胞數(shù)評分與陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度評分的乘積為最終得分；陽性細(xì)胞數(shù)分級：0～1%計(jì)0分，1%～10%計(jì)1分，10%～50%計(jì)2分，50%～80%計(jì)3分，80%～100%計(jì)4分；陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級：陰性計(jì)0分，弱陽性計(jì)1分，陽性計(jì)2分，強(qiáng)陽性計(jì)3分。

1.3.4 血清炎性因子檢測： 動物麻醉狀態(tài)下，采集左心房血2 ml，離心分離上層血清。采用ELISA法檢測大鼠血清IL-2、IL-1β和TNF-α的水平。參照ELISA試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況及神經(jīng)功能評分比較 NC組大鼠精神狀況良好，毛發(fā)光亮，進(jìn)食飲水正常，體質(zhì)量呈緩慢增長；EAE組大鼠免疫后開始出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)不光滑、食欲不振及體質(zhì)量減輕等，第9天時(shí)開始有發(fā)病癥狀：后肢無力和尾部癱瘓，嚴(yán)重時(shí)雙后肢甚至四肢癱瘓，大小便失禁，處于瀕死狀態(tài)。 α-LA組大鼠免疫后第12 d開始出現(xiàn)上述癥狀，但癥狀較EAE組有所改善。與EAE組比較，α-LA組大鼠發(fā)病后0、7及14 d時(shí)神經(jīng)功能評分均降低(P<0.01)，見表1。

表1 大鼠發(fā)病不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評分比較分)

2.2 各組大鼠脊髓腰膨大組織病理學(xué)變化比較 NC組大鼠脊髓腰膨大組織著色均勻，結(jié)構(gòu)完整，未見明顯異常；EAE組出現(xiàn)明顯的“袖套樣”改變，伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤；α-LA組仍可見大鼠“袖套樣”改變和炎性細(xì)胞浸潤，但病理組織改變較EAE組輕，2組各時(shí)期病理組織變化差異不明顯，見圖1。

2.3 各組大鼠NF-κB和IκB表達(dá)比較 與NC組比較，EAE組NF-κB表達(dá)水平發(fā)病后0 d時(shí)較高、7 d時(shí)減低、14 d時(shí)升高接近0 d時(shí)，IκB變化趨勢則與之相反；α-LA組發(fā)病后0 d時(shí)NF-κB表達(dá)水平較高，隨時(shí)間延長呈持續(xù)降低趨勢，IκB變化趨勢則與之相反。與EAE組比較，α-LA組各時(shí)期NF-κB表達(dá)均降低，IκB表達(dá)均升高(P<0.05)，見圖2、3及表2。

表2 各組大鼠NF-κB和IκB表達(dá)的免疫組化評分比較分)

2.4 各組大鼠血清炎性因子水平比較 EAE組血清IL-2、IL-1β和TNF-α水平發(fā)病后0 d時(shí)較高、7 d時(shí)減低、14 d時(shí)升高接近于0 d時(shí)， α-LA組發(fā)病后0 d時(shí)上述因子處于較高水平，隨時(shí)間延長呈持續(xù)降低趨勢。與NC組比較，EAE組血清IL-2、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)；與EAE組比較，α-LA組各時(shí)點(diǎn)血清炎性因子水平均降低(P<0.05)，見表3。

3 討 論

多發(fā)性硬化是一種自身免疫性疾病，因其緩解—復(fù)發(fā)的病程特點(diǎn)，會造成不可逆性神經(jīng)損傷，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前，多發(fā)性硬化的治療以減輕癥狀為主，緩解時(shí)期的治療圍繞降低復(fù)發(fā)率、延緩疾病的進(jìn)程展開，緩解期常用藥物有干擾素、免疫抑制劑等，但此類藥物價(jià)格昂貴，且大多會有不同程度的不良反應(yīng)，影響其臨床實(shí)用性[9]。因此，開發(fā)多發(fā)性硬化的治療藥物仍是近年來的研究熱點(diǎn)。關(guān)于多發(fā)性硬化的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但眾多研究指出，多發(fā)性硬化屬于免疫因素介導(dǎo)的炎性反應(yīng)性病變，而炎性細(xì)胞浸潤是多發(fā)性硬化最具標(biāo)志性的特征之一[10]。其主要發(fā)病機(jī)制為：外部因素刺激T細(xì)胞的活化，使其進(jìn)入腦組織分泌大量的炎性細(xì)胞因子，進(jìn)一步促進(jìn)B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，并募集外周血中的T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞等至反應(yīng)區(qū)域，最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)損傷[11]。NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可啟動細(xì)胞炎性反應(yīng)。Zhang等[12]研究指出，NF-κB通路在EAE大鼠中特異性激活，而敲除NF-κB后EAE大鼠血腦屏障破壞及炎性損傷明顯減輕，表明NF-κB參與EAE的發(fā)病過程。

α-LA是臨床應(yīng)用廣泛且安全性較高的常見藥物，主要應(yīng)用于改善糖尿病患者周圍神經(jīng)病變[13-14]。近年來，大量研究結(jié)果顯示，α-LA除抗氧化作用外，還兼具抗炎和神經(jīng)保護(hù)的作用[15-16]。Khalili等[17]研究表明，α-LA對多發(fā)性硬化患者有較好的療效，但α-LA的具體保護(hù)機(jī)制還不清楚。EAE動物模型與人類多發(fā)性硬化具有相似的臨床、免疫及病理特征。本研究通過對Wistar大鼠注射豚鼠新鮮的脊髓生理鹽水勻漿液，成功構(gòu)建EAE大鼠模型，免疫后的大鼠于第9 d時(shí)開始有后肢無力和尾部癱瘓等癥狀，并具有緩解—復(fù)發(fā)的發(fā)病特點(diǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[18]。通過評價(jià)各組大鼠神經(jīng)功能評分，發(fā)現(xiàn)對于EAE大鼠緩解和復(fù)發(fā)時(shí)期，α-LA均可明顯減輕大鼠神經(jīng)功能損傷，改善脊髓腰膨大組織病理學(xué)變化，與Waslo等[19]研究結(jié)果相符。NF-κB在自身免疫功能中有重要作用，正常狀態(tài)下NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合物存在于胞漿中，胞外刺激可降解IκB而激活NF-κB，后者以二聚體形式進(jìn)入胞核介導(dǎo)炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，NF-κB/IκB及相關(guān)炎性因子(IL-2、IL-1β及TNF-α)水平在EAE大鼠中的表達(dá)與其病情緊密相關(guān)，發(fā)病高峰期NF-κB及炎性因子表達(dá)高，緩解期表達(dá)降低，而復(fù)發(fā)期又升高，IκB的表達(dá)趨勢則與之相反，進(jìn)一步驗(yàn)證了NF-κB介導(dǎo)炎性反應(yīng)參與疾病的發(fā)生發(fā)展。EAE大鼠經(jīng)α-LA處理后，各時(shí)期NF-κB和炎性因子的表達(dá)明顯降低，IκB的表達(dá)明顯升高，說明α-LA通過調(diào)控NF-κB/IκB的表達(dá)，在EAE大鼠中發(fā)揮抗炎作用，保護(hù)大鼠神經(jīng)損傷，這與Zhang等[20]報(bào)道α-LA可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，發(fā)揮抗炎作用相符。

注：箭頭指示“袖套樣”改變和炎性細(xì)胞浸潤

圖2 各組大鼠脊髓腰膨大組織中NF-κB表達(dá)情況(DAB染色，×400)

圖3 各組大鼠脊髓腰膨大組織中IκB表達(dá)情況(DAB染色，×400)

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血清炎性因子水平比較

綜上所述，α-硫辛酸可明顯減輕EAE大鼠神經(jīng)損傷，其抗炎機(jī)制可能與下調(diào)NF-κB表達(dá)，并上調(diào)IκB表達(dá)有關(guān)，后期將深入探討α-硫辛酸在EAE大鼠中的抗炎作用機(jī)制，為α-硫辛酸用于多發(fā)性硬化的臨床治療提供參考。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

檀紅玲、梁丹：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；檀國軍：課題設(shè)計(jì)；馬玉騰：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;韓梅、高夢穎：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改;張軍立：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析