李增明

（江西省婦幼保健院，南昌 330006）

出生缺陷是指出生以前就已發(fā)生的身體功能上、結(jié)構(gòu)上，或代謝的異常，出生缺陷是導(dǎo)致死胎、流產(chǎn)、嬰幼兒死亡和先天性殘障的主要原因之一，預(yù)防和減少出生缺陷，是提高出生人口素質(zhì)、實(shí)施健康中國行動(dòng)和奪取脫貧攻堅(jiān)全面勝利的內(nèi)在要求。為了降低出生缺陷發(fā)生率，WHO 提出了出生缺陷的三級預(yù)防策略[1,2]。出生缺陷發(fā)生的原因主要包括遺傳因素、環(huán)境因素以及遺傳環(huán)境兩因素相互作用，建立高靈敏度、高特異性、高通量和穩(wěn)定性好的出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)評估預(yù)測、篩查、診斷和鑒別診斷及成因因素分析檢測方法，對于出生缺陷的防控具有重要意義[3,4]，質(zhì)譜分析的精準(zhǔn)定性定量特性使得其可為出生缺陷的篩查、診斷和鑒別診斷和成因分析提供科學(xué)依據(jù)，因此質(zhì)譜技術(shù)在出生缺陷防控中發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)對質(zhì)譜技術(shù)在出生缺陷防控中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為質(zhì)譜技術(shù)在出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、篩查、檢測和診斷中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 質(zhì)譜技術(shù)概述

質(zhì)譜是眾多分析技術(shù)中同時(shí)具備了靈敏度高、特異性好、響應(yīng)速度快的普適性分析檢測方法，在諸多分析測試領(lǐng)域均有非常廣泛的應(yīng)用。目前已有13 個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)授予了與質(zhì)譜技術(shù)的誕生和發(fā)展以及有關(guān)應(yīng)用方面的研究。2002 年，美國芬恩教授和日本田中耕一教授發(fā)明了生物大分子質(zhì)譜分析法，獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)[5]。

質(zhì)譜技術(shù)由于其在靈敏度和特異性上的突出優(yōu)勢，適合于復(fù)雜臨床生物樣本的分析檢測，該技術(shù)在臨床檢測和診斷領(lǐng)域的發(fā)展尤為迅猛。目前質(zhì)譜技術(shù)除了已成為臨床小分子化合物的主要質(zhì)控參考方法外，在臨床內(nèi)分泌、治療藥物監(jiān)測、新型生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)分析等臨床檢測領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，可為疾病的診斷提供準(zhǔn)確可靠的臨床依據(jù)，在臨床檢測診斷領(lǐng)域發(fā)揮愈來愈重要的作用。質(zhì)譜分析的精準(zhǔn)定性定量特性在臨床分析特別是在精準(zhǔn)醫(yī)療方面提供了快速可靠的解決方案。目前質(zhì)譜技術(shù)的臨床應(yīng)用主要是對人體的體液 （如血液、尿液、唾液等）和人體組織切片的分析，揭示疾病的相關(guān)信息，對生理病理研究和臨床診斷具有重要意義。質(zhì)譜技術(shù)在出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測、篩查、檢測和診斷中的應(yīng)用具有如下優(yōu)勢：質(zhì)譜技術(shù)具有突出的特異性；靈敏度高也是質(zhì)譜技術(shù)的另外一個(gè)突出優(yōu)勢；質(zhì)譜技術(shù)具有多通道檢測能力，可以同時(shí)檢測多種化合物，因此通量較高，所需樣本量少。

2 質(zhì)譜技術(shù)在出生缺陷一級預(yù)防中的應(yīng)用

出生缺陷的一級預(yù)防手段主要是通過婚前、孕前醫(yī)學(xué)檢查和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷 （Preimplantation Genetic Diagnosis，PGD）實(shí)現(xiàn)。通過婚前、孕前篩查和PGD 防治出生缺陷，國內(nèi)外都有成效顯著的先例。針對遺傳相關(guān)的出生缺陷，以單細(xì)胞高通量檢測方法為核心的PGD 技術(shù)，相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，構(gòu)建新型、主動(dòng)、精準(zhǔn)且高效的遺傳性出生缺陷孕前發(fā)現(xiàn)診斷、胚胎植入前即可阻斷的出生缺陷防控新模式，創(chuàng)建有特色優(yōu)生和防控關(guān)口前移的新模式。PGD 技術(shù)是對胚胎或極體或卵子行卵裂球/滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行活檢，開展染色體和/或基因組學(xué)篩查檢測，檢測結(jié)果可提示胚胎攜帶的遺傳變異情況，進(jìn)而疾病的精準(zhǔn)分類和精準(zhǔn)診斷，選擇未攜帶基因和染色體異常的胚胎植入子宮進(jìn)而出生健康新生兒的方法。PGD 技術(shù)可以從根源上解決生育遺傳性出生缺陷問題，其通過只移植健康胚胎，進(jìn)而可以進(jìn)行一級預(yù)防遺傳相關(guān)出生缺陷新生兒的出生，可以避免產(chǎn)前診斷有創(chuàng)性操作導(dǎo)致的感染、出血以及流產(chǎn)等并發(fā)癥發(fā)生，避免孕婦懷遺傳病胎兒時(shí)經(jīng)受的身心損害，并且徹底阻斷了致病基因遺傳，真正實(shí)現(xiàn)了優(yōu)生優(yōu)育，是目前臨床精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用的典范[6]。

在婚前孕前醫(yī)學(xué)檢查和PGD 中，脫氧核糖核酸分析對于遺傳性出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、篩查和檢測非常重要，因此,建立和發(fā)展靈敏、快速、高效和精準(zhǔn)的DNA 各種性質(zhì)的分析方法具有重要意義。在20 世紀(jì) 80 年代末，Tanaka 等提出基體輔助激光解吸電離技術(shù)，并與飛行時(shí)間質(zhì)譜相結(jié)合，產(chǎn)生了“軟”電離的基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)，目前，MALDI-TOF-MS已被應(yīng)用于脊髓性肌肉萎縮癥基因檢測、地中海貧血基因檢測、G6PD 基因突變檢測和葉酸代謝相關(guān)基因檢測等[7,8]。傳統(tǒng)的DNA 分析方法主要有熒光定量PCR、數(shù)值化PCR 和毛細(xì)管測序法，其缺點(diǎn)是通量較低單次分析檢測的位點(diǎn)少，新興的基因芯片法、二代測序和單分子測序用于DNA 分析優(yōu)點(diǎn)是高通量且獲得的信息量大，其缺點(diǎn)是成本高、周期長、操作復(fù)雜、解讀難，而飛行時(shí)間質(zhì)譜用于DNA 分析具有中通量且可以多基因多位點(diǎn)分析，具有準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。

神經(jīng)管畸形 ( Neural tube defects，NTDs) 是指神經(jīng)管具有缺陷導(dǎo)致的嚴(yán)重先天性畸形，補(bǔ)充合適劑量的葉酸是降低NTDs 發(fā)病率的重要預(yù)防措施。然而，葉酸過量也存在一定的副反應(yīng)：過量劑量的葉酸會掩蓋進(jìn)而加重維生素B12缺乏引發(fā)的相關(guān)癥狀，過量劑量的葉酸不適合預(yù)防NTDs，還可能會引發(fā)智力及發(fā)育障礙等。再者也不是所有的NTDs 通過補(bǔ)充葉酸都可以進(jìn)行預(yù)防。因此葉酸及其代謝產(chǎn)物的分析檢測對于NTDs 風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測和評估及指導(dǎo)精準(zhǔn)補(bǔ)充葉酸非常重要。黃敏等[9]建立了基于液相色譜質(zhì)譜方法的葉酸及葉酸的代謝產(chǎn)物5-甲?；臍淙~酸、5-甲基四氫葉酸、同型半胱氨酸、組氨酸和絲氨酸的檢測方法并用于NTDs 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評估和預(yù)測具有很好的陽性預(yù)測值。

早期生命的各種影響因素是生命體出現(xiàn)疾病的最早影響因素，這種作用甚至可以決定個(gè)體未來的健康情況。Baker 等發(fā)表 “成人疾病胎源學(xué)說”，該學(xué)說認(rèn)為宮內(nèi)受到有害因素暴露或營養(yǎng)不良，會導(dǎo)致胎兒的組織器官在功能和結(jié)構(gòu)上發(fā)生程序性或永久性改變，這些變化增加了出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。目前我國環(huán)境污染形勢嚴(yán)峻，孕前進(jìn)行環(huán)境有害物質(zhì)暴露水平的檢測和評估對預(yù)防出生缺陷有重要意義。要準(zhǔn)確真實(shí)評估環(huán)境有害物質(zhì)暴露水平和劑量，首先得建立高靈敏度、高特異性、高通量且穩(wěn)定性好的分析檢測方法。質(zhì)譜技術(shù)由于其在靈敏度和特異性上的突出優(yōu)勢，適合于復(fù)雜臨床生物樣本的分析檢測，越來越受到重視。Yang BC 等[10]發(fā)展了固相基底電噴霧電離直接質(zhì)譜技術(shù)，在無需樣品預(yù)處理的情況下，以醫(yī)用棉簽取樣后直接耦合在納升電噴霧電離質(zhì)譜儀上，實(shí)現(xiàn)了尼古丁和可替寧直接快速定性定量分析，1min 內(nèi)可以完成一個(gè)樣本的檢測，大大提高了分析速度，節(jié)約時(shí)間的同時(shí)也節(jié)約了大量溶劑成本。經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展同時(shí)帶來了城市機(jī)動(dòng)車輛的快速增長，冬季燃煤取暖和機(jī)動(dòng)車尾氣排放造成的環(huán)境污染問題日益突出，多環(huán)芳烴化合物就是不可忽視的重點(diǎn)污染物之一。來自世界范圍的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)人體尿液中多環(huán)芳烴代謝物檢出率大于90%，提示人類普遍暴露于多環(huán)芳烴。近年來評估人體接觸多環(huán)芳烴的暴露情況已成為新的研究熱點(diǎn)，目前研究表明多環(huán)芳烴具有致癌、致突變和發(fā)育毒性，而孕婦作為易感人群，孕前及婚前進(jìn)行多環(huán)芳烴暴露水平的評估對于指導(dǎo)生育具有重要意義，Yang BC 等[11]發(fā)展了固相微萃取-玻璃毛細(xì)管納升電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)，在無需樣品預(yù)處理的情況下，實(shí)現(xiàn)了人尿液中多環(huán)芳烴六種代謝物的快速定性定量分析，1 分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)樣本的檢測，大大提高了分析速度。

3 質(zhì)譜技術(shù)在出生缺陷二級預(yù)防中的應(yīng)用

產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷是預(yù)防出生缺陷的第二道防線。采用 PCR 技術(shù)、Sanger 測序技術(shù)、SNP array 和NGS 對羊水細(xì)胞或絨毛膜組織基因檢測在遺傳代謝缺陷病的產(chǎn)前診斷中發(fā)揮著重要作用，基因檢測的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確，可明確是患者、攜帶者或無攜帶，缺點(diǎn)是基因型和表型相關(guān)性問題：單個(gè)遺傳基因座的不同突變可以不同的疾病，并且不同的個(gè)體中相同的突變可以引起不同嚴(yán)重程度的疾病?；蚪M學(xué)結(jié)果反映的是什么是可以發(fā)生的，轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果反映的是什么是即將發(fā)生的，蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果反映的是什么是正在發(fā)生的，只有代謝組學(xué)結(jié)果才真正反映什么是已發(fā)生的，因此采用質(zhì)譜方法檢測羊水中代謝產(chǎn)物水平的變化有助于一些遺傳代謝缺陷病的明確產(chǎn)前診斷，且羊水代謝產(chǎn)物檢測分析速度更快。如在有機(jī)酸血癥胎兒的產(chǎn)前診斷中，健康孕婦羊水里?；鈮A水平和有機(jī)酸代謝產(chǎn)物濃度都很低，但懷有有機(jī)酸血癥胎兒的孕婦羊水中這些酰基肉堿和有機(jī)酸代謝產(chǎn)物會顯著增高，結(jié)合基因檢測的結(jié)果和羊水氣相色譜質(zhì)譜代謝產(chǎn)物測定結(jié)果,有助于提高產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性。并且在不同孕期孕婦羊水中有機(jī)酸和酰基肉堿水平并無明顯差異。韓鳳等[12]探討了氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及液相色譜質(zhì)譜測定羊水中的有機(jī)酸即酰基肉堿水平用于丙酸血癥胎兒產(chǎn)前診斷的應(yīng)用價(jià)值。收集40 例進(jìn)行產(chǎn)前診斷且生育過丙酸血癥患兒的孕婦作為丙酸血癥母親組。從同期進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)前診斷孕婦中隨機(jī)選取40例作為對照組。兩組孕婦都是在妊娠16～20 周通過羊膜腔穿刺術(shù)抽取得到羊水，然后通過液相色譜質(zhì)譜測定羊水丙酰肉堿和乙酰肉堿濃度,通過氣相色譜質(zhì)譜測定羊水中甲基枸櫞酸和3-羥基丙酸濃度,羊水細(xì)胞進(jìn)行基因檢測。結(jié)果丙酸血癥母親組孕婦羊水丙酰肉堿和甲基枸櫞酸水平均高于對照組,可利用串聯(lián)質(zhì)譜及氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)檢測羊水中的丙酰肉堿、甲基枸櫞酸水平,對先證者為丙酸血癥的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

地中海貧血是世界上最常見的單基因遺傳病之一，通過二級預(yù)防產(chǎn)前診斷是地中海貧血防控的重要措施之一，母血漿胎兒游離核酸的發(fā)現(xiàn)為地貧的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了新的途徑。近些年來,飛行時(shí)間質(zhì)譜分析已應(yīng)用于針對地貧遺傳缺陷(特別是β 地貧點(diǎn)突變)的母血漿胎兒游離DNA 檢測[13]。

4 質(zhì)譜技術(shù)在出生缺陷三級預(yù)防中的應(yīng)用

新生兒篩查是預(yù)防出生缺陷的最后一道防線。1990 年時(shí)來自美國杜克大學(xué)的陳垣崇教授團(tuán)隊(duì)成員Millington 博士率先提出采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)開展新生兒遺傳代謝性疾病的篩查[14]。1995 年時(shí)Rashed 等利用電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行新生兒代謝性疾病的篩查，篩查出丙酸血癥、短鏈及中鏈酰基輔酶A 脫氫酶缺乏癥、甲基丙二酸血癥等多種遺傳代謝病[15]。電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)是一種軟電離技術(shù)，該技術(shù)與自動(dòng)連續(xù)進(jìn)樣器聯(lián)用，應(yīng)用自動(dòng)進(jìn)樣器提升了分析的速度和準(zhǔn)確度，使得分析通量大大提升，為大規(guī)模進(jìn)行新生兒遺傳代謝病篩查奠定了有利條件，從此各新生兒疾病篩查實(shí)驗(yàn)室開始使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行新生兒遺傳代謝病篩查。

采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行新生兒遺傳代謝病篩查，其在2-3 分鐘內(nèi)對每個(gè)標(biāo)本可同時(shí)測定幾十種小分子代謝物，測定物質(zhì)包括氨基酸及脂肪酸線粒體氧化代謝紊亂和有機(jī)酸障礙在內(nèi)的40 余種遺傳代謝性疾病，使得新生兒遺傳代謝性疾病的篩查從“一次實(shí)驗(yàn)只能篩查一種疾病”向“一次實(shí)驗(yàn)可篩查多種疾病” 轉(zhuǎn)變，質(zhì)技術(shù)具有靈敏度高、、分析速度快且分析通量高的優(yōu)點(diǎn)，質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于新生兒遺傳代謝病篩查不僅增加了篩查疾病的病種，還大大提高了篩查的速率及篩查的準(zhǔn)確性和特異性，進(jìn)而使得新生兒遺傳代謝病的篩查進(jìn)入到新紀(jì)元。

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)通過聯(lián)合二級檢驗(yàn)指標(biāo)能夠有效地改善傳統(tǒng)篩查性能。比如，先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥常規(guī)篩查的生物標(biāo)志物是17α-羥孕酮，但假陽性率很高。Minutti 等[16]發(fā)展了基于 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測定血斑中雄烯二酮、17α-羥孕酮等類固醇類物質(zhì)，這種二級篩查能夠識別常規(guī)篩查中的假陽性結(jié)果。11β-羥化酶缺陷癥引發(fā)的先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥較為罕見，其不是新生兒遺傳代謝病篩查檢測的主要疾病。然而標(biāo)準(zhǔn)的免疫實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)中，患兒的17α-羥孕酮水平會輕度增加。Peter 等[17]發(fā)展了基于 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對通過免疫測定法發(fā)現(xiàn)的17α-羥孕酮濃度增高的患兒的血片進(jìn)行二級篩查檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種血片中雄烯二酮和11-脫氧皮質(zhì)醇水平升高，而皮質(zhì)醇濃度降低，結(jié)合家族病史即可診斷為11β-羥化酶缺陷癥。通過濾紙干血斑檢測總高胱氨酸水平已成為現(xiàn)實(shí)，就是在出生后3 天內(nèi)采濾紙干血斑，這種檢測方法的敏感性還可達(dá)到100%，因此可以發(fā)展為新生兒高胱氨酸尿癥檢測首選方法。再而，串聯(lián)質(zhì)譜遺傳代謝病的陽性篩查結(jié)果不僅僅是一種代謝物的水平的變化，還可以多指標(biāo)提示，這大大提高了遺傳代謝病篩查的特異性和敏感性，使得篩查檢出率比臨床診斷更高。

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測尿液中有機(jī)酸水平對于有機(jī)酸血癥等遺傳代謝缺陷病的篩查、診斷和鑒別診斷具有重要作用，與串聯(lián)質(zhì)譜檢測濾紙干血斑中的氨基酸肉堿水平相比，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測尿液中有機(jī)酸水平操作復(fù)查，通量較低，限制了其大規(guī)模開展，下一步有必要研發(fā)簡便快速高通量準(zhǔn)確的尿液中有機(jī)酸水平質(zhì)譜分析檢測方法。

溶酶體貯積癥由于基因突變引發(fā)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或溶酶體酶缺乏進(jìn)而造成底物在溶酶體內(nèi)聚集而引發(fā)的一類遺傳代謝疾病，多數(shù)為常染色體隱性遺傳，也有部分為X 染色體連鎖遺傳。溶酶體貯積癥會損傷全身多種器官，首先是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，溶酶體貯積癥的臨床癥狀具有進(jìn)行性發(fā)展特點(diǎn)，如果沒有及時(shí)治療或許引發(fā)患者死亡或終身殘疾。我國大陸目前還沒有進(jìn)行新生兒溶酶體貯積癥的群體篩查，造成許多溶酶體貯積癥患兒無法早發(fā)現(xiàn)早治療，因此開展新生兒溶酶體貯積癥群體篩查有重要意義。溶酶體貯積癥的群體篩查方法主要有：質(zhì)譜技術(shù)、多免疫定量法和熒光法。熒光法由于非特異性其不能同時(shí)測定多種酶的活性因此假陽性高，多免疫定量法目前還沒批準(zhǔn)試劑盒，而質(zhì)譜技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、靈敏度好且一次檢測篩查發(fā)現(xiàn)多種疾病，因而在溶酶體貯積癥群體篩查中有優(yōu)勢。萬智慧等[18]利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測6 種溶酶體貯積癥：戈謝病、尼曼匹克病A/B、克拉伯病、黏多糖貯積癥I 型、法布里病和龐貝病的篩查指標(biāo)，評估質(zhì)譜方法用于新生兒6 種溶酶體貯積癥篩查的可行性。結(jié)果表明質(zhì)譜方法適用于6 種溶酶體貯積癥的新生兒篩查，也可用于相關(guān)6 種溶酶體貯積癥患者治療后的酶活監(jiān)測，為串聯(lián)質(zhì)譜法篩查溶酶體貯積癥奠定了基礎(chǔ)。

我國現(xiàn)在殘疾人8296 萬，其中聽力障礙人群高達(dá)2780 萬。遺傳因素是致聾的主要因素之一，新生兒物理聽力篩查聯(lián)合耳聾基因篩查是防聾控聾的最佳策略。付華鈺等[19]比較了芯片法和飛行時(shí)間質(zhì)譜法在非綜合征性耳聾基因篩查中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)兩種方法檢測結(jié)果并無顯著差異，飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的檢測位點(diǎn)多且檢出率高，這在一定程度可減少漏篩率，在大規(guī)模人群耳聾基因篩查中有其優(yōu)勢，但飛行質(zhì)譜方法方法所需的儀器設(shè)備成本較高，對檢測人員的專業(yè)水平要求較高。

5 結(jié)語

質(zhì)譜技術(shù)在出生缺陷三級預(yù)防中均有所應(yīng)用，但應(yīng)用最為廣泛的是串聯(lián)質(zhì)譜新生兒遺傳代謝病篩查，其優(yōu)勢在于操作方便、高通量、篩查病種多。質(zhì)譜技術(shù)優(yōu)勢是靈敏度高、特異性好、可多通道檢測同時(shí)檢測多種化合物。質(zhì)譜技術(shù)出生缺陷的進(jìn)一步應(yīng)用存在一些瓶頸，如影響結(jié)果可靠性和重現(xiàn)性的因素多；如基質(zhì)效應(yīng)、干擾、源內(nèi)變構(gòu)及方法標(biāo)準(zhǔn)化跟免疫法比較，質(zhì)譜法自動(dòng)化程度還是很低，需要樣品處理和色譜分離，手工操作難以避免，難以實(shí)現(xiàn)隨機(jī)插入同時(shí)也面臨法規(guī)上的瓶頸；如相關(guān)規(guī)范性文件和收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。