肖文香，張萌匯，鄧聰敏，劉子卓，李 華

(1. 桂林電子科技大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004；2. 廣西自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004)

0 引 言

膽紅素是由血紅蛋白分解代謝產(chǎn)生的一種生物活性物質(zhì)。健康成年人體內(nèi)每天約產(chǎn)生250～300 mg膽紅素，新生兒膽紅素的產(chǎn)生量更高[1]。血液膽紅素濃度過高會(huì)引發(fā)肝、膽機(jī)能失調(diào)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和大腦造成永久性的損傷[2]。如何高效、及時(shí)地去除血液內(nèi)過量的游離膽紅素是臨床上治療高膽紅素血癥的核心和關(guān)鍵?；谖皆淼难汗嗔鳢煼ㄊ乔宄懠t素的有效方法之一[3]，其療效取決于吸附劑的性能。關(guān)于膽紅素吸附劑，圍繞著如何提高吸附量、改善材料的生物相容性等方面，開展了很多研究工作。

傳統(tǒng)的膽紅素吸附劑材料為活性炭、樹脂等，納米材料在吸附劑領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力[4-8]。介孔硅具有粒徑、孔道可控及比表面積大、生物相容性好等特點(diǎn)，因而是一類高效的膽紅素吸附劑。為了增強(qiáng)介孔硅對(duì)膽紅素的吸附量及吸附選擇性，通常對(duì)介孔硅進(jìn)行功能化，以引入能與膽紅素結(jié)合的特定功能基團(tuán)，如氨基[9]、牛血清白蛋白(BSA)[10]、氨基酸[11]、含胍聚合物[12]等。

以上介孔硅膽紅素吸附劑存在的缺點(diǎn)是吸附平衡時(shí)間長(zhǎng)(>1 h),吸附量不高(<100 mg/g)。為了加快吸附速率，采用具有小孔徑和較大孔徑兩種介孔孔道的雙介孔硅作為吸附劑，大孔徑介孔孔道能促進(jìn)膽紅素在孔道擴(kuò)散，從而縮短吸附平衡時(shí)間。通過在雙介孔硅中引入葡萄糖醛酸基團(tuán)，達(dá)到提高膽紅素吸附量和選擇性吸附的目的。葡萄糖醛酸是葡萄糖的一種衍生物，在肝臟中，游離膽紅素在葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶的作用下與葡萄糖醛酸結(jié)合，生成水溶性的直接膽紅素進(jìn)而被肝臟代謝，說明膽紅素與葡萄糖醛酸之間具有較好的相互作用。模擬該生理過程，采用葡萄糖醛酸對(duì)雙介孔硅進(jìn)行功能化，這也是提高材料水溶性、生物相容性的有效手段[13]。同時(shí)由于葡萄糖醛酸不是蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)膽紅素與血清蛋白共存時(shí)，增強(qiáng)了吸附劑對(duì)膽紅素的吸附選擇性[14]。葡萄糖醛酸功能化雙介孔硅實(shí)現(xiàn)了對(duì)膽紅素的快速、選擇性吸附。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器和試劑

硅酸鈉、乙酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、膽紅素、D-葡萄糖醛酸、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)等試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

實(shí)驗(yàn)中用到的主要儀器有集熱式磁力攪拌器(上海力辰)、UH5300紫外可見分光光度計(jì)(Hitachi)、H-800透射電鏡(TEM，加速電壓200 kV)、X射線衍射儀( Philip X′pert pro)、傅里葉變換紅外光譜儀 (FTIR, Thermo Nicolet NEXUS 670)、N2吸附分析儀(Quantachrome Autosorb iQ2)。

1.2 吸附劑的制備

雙介孔硅(BMS)參照文獻(xiàn)制備[15]。采用乙酸乙酯的水解來控制合成溶液的pH值。合成反應(yīng)在能耐受壓力的聚丙烯反應(yīng)釜中進(jìn)行，溫度約為30 ℃。將19.6 g的CTMAB完全溶解在350 mL的二次蒸餾水中，再加入10 g的Na2SiO3固體，攪拌，得到澄清溶液。在攪拌作用下，向溶液中迅速加入35 mL的乙酸乙酯，30 s后停止攪拌,最終反應(yīng)物的摩爾比為n(Na2-SiO3)∶n(CTMAB)∶n(H2O)∶n(乙酸乙酯)=1∶0.66∶237∶4.36。混合溶液在室溫下放置5 h后，將溶液置于90 ℃保溫50 h。老化完成后，趁溶液還溫?zé)釙r(shí)過濾，得到的固體依次用蒸餾水、無水乙醇充分洗滌，60 ℃真空干燥，最后于600 ℃在空氣氣氛中灼燒20 h，以除去模板劑。

將1 g的雙介孔硅與4 mL的濃氨水(28%質(zhì)量分?jǐn)?shù))超聲15 min，加入300 mL無水乙醇、2 mL APTES，再超聲30 min，室溫劇烈攪拌反應(yīng)3 h，過濾，用無水乙醇洗滌，得到氨基化雙介孔硅(NH2-BMS)。

將D-葡萄糖醛酸(0.3 g)、EDC(0.3 g)和NHS(0.45 g)溶于300 mL的蒸餾水，37 ℃活化15 min，再加入1 g氨基化雙介孔硅，室溫下攪拌過夜。之后過濾、蒸餾水洗滌，60 ℃真空干燥，得到淡黃色的葡萄糖醛酸功能化雙介孔硅(Glu-BMS)。

1.3 葡萄糖醛酸功能化雙介孔硅對(duì)膽紅素的吸附

膽紅素固體先用少許0.02 mol/L NaOH溶液溶解，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至近中性，再用10 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)稀釋，得到相應(yīng)濃度的膽紅素溶液，4 ℃避光保存。由于膽紅素溶液見光容易氧化變質(zhì)，因此在溶液配制過程中應(yīng)注意避光操作。

吸附實(shí)驗(yàn)采用批實(shí)驗(yàn)法在避光條件下進(jìn)行，將4 mL膽紅素溶液和5 mg吸附劑混合，在一定溫度下恒溫振蕩(100 r/min)一定時(shí)間后，用0.45 μm膜過濾器過濾，測(cè)定438 nm處濾液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出膽紅素的濃度，平行測(cè)定3次，并按式(1)計(jì)算吸附量Q

(1)

式中Q為吸附量(mg/g)，C0與C為吸附前后膽紅素的濃度(mg/mL),m為吸附劑的質(zhì)量(g)。以不加吸附劑的膽紅素溶液作為空白對(duì)照，扣除空白值后，得到吸附劑的實(shí)際吸附量。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附劑的表征

介孔硅具有均勻的孔道和較大的比表面積，因而具有良好的吸附性能。為了加快傳質(zhì)速率，提高吸附劑對(duì)膽紅素的吸附速度，因而選用具有介孔及較大孔道的雙介孔硅作為目標(biāo)吸附劑。從圖1TEM圖可知，制備得到的雙介孔硅為球形顆粒，顆粒直徑約為200 nm，從顆粒的邊緣部分可以明顯看出其納米孔結(jié)構(gòu)。小角XRD譜顯示，雙介孔硅具有一定的MCM-41相成分，譜峰較寬，表明介孔硅孔壁晶化程度不高；葡萄糖醛酸功能化前后雙介孔硅XRD峰基本不變，說明功能化對(duì)介孔硅的結(jié)構(gòu)影響不大。

圖1 雙介孔硅的TEM圖(a)和XRD圖(b)Fig 1 TEM image and XRD spectra of the adsorbents

圖2 N2吸附等溫線(a)與FT-IR圖(b)Fig 2 N2 adsorption-desorption isotherms and FT-IR spectra of the adsorbents

表1 吸附劑參數(shù).Table 1 Physical parameters of the adsorbents

2.2 葡萄糖醛酸化雙介孔硅對(duì)膽紅素的吸附

2.2.1 吸附時(shí)間對(duì)膽紅素吸附的影響

將5 mg的Glu-BMS吸附劑加入4 mL 0.1 mg/mL膽紅素溶液中，準(zhǔn)備8份同樣的樣品，23 ℃恒溫振蕩，當(dāng)吸附時(shí)間分別5、7、10、15、20、30、50和70 min時(shí)，取出一個(gè)樣品，過濾，測(cè)定膽紅素溶液濃度，計(jì)算吸附量，結(jié)果如圖3(a)所示。當(dāng)吸附時(shí)間小于10 min時(shí)，隨著吸附時(shí)間延長(zhǎng)，Glu-BMS、BMS對(duì)膽紅素的吸附急劇增加，吸附平衡時(shí)間分別為15和10 min。與BMS相比，Glu-BMS的吸附平衡時(shí)間變長(zhǎng)了，原因在于經(jīng)過葡萄糖醛酸功能化之后，介孔的孔徑與孔容積減小(表1)，膽紅素的傳質(zhì)速度有所降低所致。僅僅具備單一孔道的介孔硅膽紅素吸附劑，其吸附平衡時(shí)間一般都大于1 h[9-12]，由此可見雙介孔孔道的引入，顯著縮短了吸附劑對(duì)膽紅素的吸附平衡時(shí)間。

2.2.2 溫度對(duì)膽紅素吸附的影響

溫度會(huì)影響吸附劑與膽紅素之間的相互作用，將樣品在一定溫度下恒溫振蕩吸附15 min，結(jié)果如圖3(b)所示。在20～42 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，BMS和Glu-BMS的吸附量均增大。BMS中的Si—OH和Glu-BMS中葡萄糖醛酸基團(tuán)中的-OH可與膽紅素的—COOH、—NH—基團(tuán)形成氫鍵而被吸附，當(dāng)吸附溫度升高時(shí)，膽紅素向介孔孔道的擴(kuò)散速度加快，形成氫鍵的數(shù)量增加，因而吸附量增大。溫度繼續(xù)升高，氫鍵被破壞，吸附量降低。Glu-BMS吸附劑的溫度適用范圍寬，在 20～42 ℃范圍內(nèi)，溫度變化所引起的吸附量誤差小于5%。

圖3 吸附時(shí)間(a)和溫度(b)對(duì)膽紅素吸附的影響Fig 3 Effect of time and temperature on bilirubin adsorption

2.2.3 初始濃度對(duì)膽紅素吸附的影響

為了確定吸附劑的飽和吸附量，吸附劑加入量不變，改變膽紅素溶液的初始濃度，在37 ℃吸附15 min，吸附量如圖4(a)所示。當(dāng)膽紅素初始濃度較低時(shí)(C0<0.3 mg/mL), 兩種吸附劑的吸附量與濃度成線性關(guān)系；當(dāng)C0>0.3 mg/mL時(shí)，濃度增大，吸附量基本不變，說明吸附劑已達(dá)到吸附飽和。Glu-BMS與BMS的飽和吸附量分別為(246.78.3)、(193.06.3)mg/g，與BMS相比，Glu-BMS的吸附量增加了27%。盡管經(jīng)過葡萄糖醛酸功能化之后，雙介孔硅的比表面積、孔徑、孔容積均有所下降，但是每引入一個(gè)葡萄糖醛酸基團(tuán)，增加了4個(gè)-OH，增強(qiáng)了吸附劑與膽紅素的氫鍵結(jié)合作用，因而對(duì)膽紅素的吸附量增大，Glu-BMS與膽紅素的作用示意圖如圖4(a)插圖所示。

2.2.4 離子強(qiáng)度對(duì)膽紅素吸附的影響

從圖4(b)可知，隨著NaCl濃度的上升，BMS和Glu-BMS對(duì)膽紅素的吸附量都有所下降，但總體上來看下降幅度不大。原因可能在于，隨著NaCl濃度增大，膽紅素分子中的-COO-周圍聚集了較多的正離子，空間位阻效應(yīng)影響了膽紅素與吸附劑之間的結(jié)合作用，導(dǎo)致吸附量略有降低。

圖4 膽紅素初始濃度(a)和離子強(qiáng)度(b)對(duì)膽紅素吸附的影響Fig 4 Effect of initial concentration and ion strength on bilirubin adsorption

2.2.5 人血清白蛋白(HSA)對(duì)膽紅素吸附的影響

人體血液中血清蛋白與膽紅素分子有著非常重要的聯(lián)系，游離膽紅素(間接膽紅素)在未進(jìn)入肝臟之前是與血清白蛋白形成復(fù)合物在血液中進(jìn)行輸運(yùn)的，進(jìn)入肝臟后膽紅素與蛋白分離后，與葡萄糖醛酸結(jié)合形成直接膽紅素隨膽汁排出。實(shí)驗(yàn)研究了HSA濃度對(duì)膽紅素吸附的影響，由圖5(a)可知，當(dāng)共存HSA的濃度從0 g/L增大至50 g/L時(shí)， Glu-BMS對(duì)膽紅素的吸附量下降了約10%；而BMS對(duì)膽紅素的吸附量則下降明顯，當(dāng)HSA的濃度為50 g/L時(shí)，吸附量下降至原來的25%。HSA能與膽紅素形成復(fù)合物，HSA-膽紅素的結(jié)合作用與吸附劑-膽紅素的結(jié)合作用形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，未功能化時(shí)，BMS-膽紅素的結(jié)合作用弱于HSA-膽紅素的作用，因而HSA濃度增大時(shí)，膽紅素吸附量下降顯著。葡萄糖醛酸功能化增強(qiáng)了Glu-BMS與膽紅素的結(jié)合作用，削弱了HSA對(duì)膽紅素吸附的影響，使Glu-BMS對(duì)膽紅素的吸附具有良好的選擇性。

圖5 HSA濃度對(duì)膽紅素吸附的影響(a)與二級(jí)動(dòng)力學(xué)曲線、Langmuir吸附等溫線(b)Fig 5 Effect of HSA on bilirubin adsorption and the kinetic and thermodynamic models for bilirubin adsorption

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)與熱力學(xué)研究

分別采用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)(式2)以及準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(式3)來描述葡萄糖醛酸功能化雙介孔硅對(duì)膽紅素的吸附動(dòng)力學(xué)行為。

lg(Qe-Q)=lgQe-k1t/2.303

(2)

(3)

式中，t為吸附時(shí)間(min)，Q為吸附t分鐘后的吸附量 (mg/g)，Qe表示平衡吸附量(mg/g)，k1為一級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)方程的速率常數(shù)(1/min)，k2為吸附動(dòng)力學(xué)方程二級(jí)速率常數(shù)(g/mg·min)。分別以log(Qe-Q)～t、對(duì)t/Q～t對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，擬合曲線的相關(guān)參數(shù)如表2所示。很顯然，葡萄糖雙介孔硅對(duì)膽紅素的吸附過程與二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型吻合較好(圖5b)，說明在膽紅素吸附過程中，化學(xué)吸附占主導(dǎo)作用。

吸附劑對(duì)物質(zhì)的吸附熱力學(xué)常用Langmuir和Freundlich等溫吸附模型來進(jìn)行研究，相關(guān)公式分別如式4、5所示。

Ce/Qe=Ce/Qm+1/(KLQm)

(4)

lnQe=(1/n)lnCe+lnKF

(5)

Ce為平衡時(shí)溶液中膽紅素的濃度(mg/L)，Qe為平衡吸附量，Qm為飽和吸附量，KL、KF為L(zhǎng)angmuir常數(shù)和Freundlich常數(shù)，分別以Ce/Qe～Ce、lgQe～lgCe作圖，擬合得到的曲線參數(shù)列于表3。從擬合曲線的相關(guān)系數(shù)R來看，很顯然Glu-BMS對(duì)膽紅素的吸附與Langmuir模型吻合較好(圖5(b)插圖)，屬于單分子層吸附，一旦吸附劑中的結(jié)合位點(diǎn)被膽紅素分子占據(jù)后，就達(dá)到飽和吸附。從Langmuir擬合曲線計(jì)算得到的理論飽和吸附量為250.0 mg/g，與實(shí)際測(cè)量得到的吸附量(246.7±8.3)mg/g相一致。目前文獻(xiàn)報(bào)道的吸附劑對(duì)膽紅素的最大吸附量大于100 mg/g的例子并不多見，R. Zhao等制備了聚乙烯亞胺接枝的靜電紡絲聚丙烯腈纖維膜，對(duì)膽紅素的吸附量為112.87 mg/g，但是其吸附平衡時(shí)間約為2 h[16]。蘇沙沙等報(bào)道的介孔碳材料吸附速度非?？?2 min), 對(duì)膽紅素的吸附量達(dá)187 mg/g，主要原因在于介孔碳擁有較高的比表面積 (1 438 m2/g)、大的孔容(0.98 cm3/g)和窄的介孔孔徑分布(平均孔徑為3.1 nm)[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過葡萄糖醛酸功能化的雙介孔硅對(duì)膽紅素具有優(yōu)異的吸附性能，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)膽紅素的快速、高效吸附。

表2 一級(jí)與二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程相關(guān)參數(shù).Table 2 First- and second-order kinetic constants for Glu-BMS

表3 Langmuir and Freundlich等溫線相關(guān)參數(shù)Table 3 Langmuir and Freundlich adsorption isotherm constants

3 結(jié) 論

模仿肝臟內(nèi)膽紅素與葡萄糖醛酸結(jié)合而被代謝的過程，通過酰胺化反應(yīng)在雙介孔硅中引入葡萄糖醛酸基團(tuán)得到葡萄糖醛酸功能化的雙介孔硅膽紅素吸附劑。該吸附劑對(duì)游離膽紅素具有優(yōu)異的吸附性能，吸附快速、高效，吸附平衡為15 min，最大吸附量為(246.7±8.3)mg/g，選擇性好，血清蛋白的存在基本不影響膽紅素的吸附。