劉榮濤，肖天華，龐貽宇，李 達(dá)，廖松義，閔永剛

(1. 廣東工業(yè)大學(xué) 材料與能源學(xué)院，廣州 510006；2. 東莞華南設(shè)計(jì)創(chuàng)新院，廣東 東莞 523808)

0 引 言

生物支架作為組織工程的基礎(chǔ)，是細(xì)胞附著、生長(zhǎng)以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)接觸和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換的載體[1，2]，應(yīng)具備高的比表面積、生物相容性、可生物降解性與合適的力學(xué)性能。研究證明，電刺激作用下可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和新組織的形成[3]。因此，制備合成導(dǎo)電可降解聚合物支架是組織工程的發(fā)展趨勢(shì)。電刺激下控制支架的降解與新組織形成速度的匹配或擬合[4，5]，減少手術(shù)的二次傷害、加快傷口愈合。

在眾多導(dǎo)電高分子中，聚苯胺因其獨(dú)特的氧化態(tài)和可調(diào)的電活性而受到廣泛研究。合成的聚苯胺基可降解聚合物支架能夠具有多孔性和生物相容性，電刺激下可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，但存在親水性、溶解性等方面的題。介紹了近年來聚苯胺基導(dǎo)電可降解聚合物研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)，展望了導(dǎo)電可降解聚合物在組織工程領(lǐng)域中的發(fā)展前景。

1 聚苯胺基可降解聚合物

目前以聚苯胺作為導(dǎo)電基體的可降解聚合物，主要通過共混、改變纖維結(jié)構(gòu)和摻雜等方法提高聚合物的導(dǎo)電性和可降解性，研究聚合物支架在有無電刺激下對(duì)細(xì)胞活性及生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。

1.1 聚苯胺與可降解聚合物共混

Li等[6]對(duì)PCL納米纖維進(jìn)行等離子體處理后，在其表面原位化學(xué)聚合PANI，得到PANI-PCL纖維，并觀察復(fù)合纖維在不同電壓刺激下對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：經(jīng)等離子體處理后的PCL負(fù)載PANI復(fù)合納米纖維表面潤(rùn)濕性好，具有良好的生物相容性，HUVECs能更好地附著、擴(kuò)散和存活；細(xì)胞與支架表面具有良好的親和力，細(xì)胞活性與增殖隨電刺激強(qiáng)度增加而增強(qiáng)，特別是在400 mV/cm時(shí)具有較強(qiáng)的黏附性和存活能力。

明膠作為一種天然可降解高分子 ，與PCL共混制備納米纖維，可以增加PCL基質(zhì)的親水性，細(xì)胞骨架基因表達(dá)證明此方法共混的納米纖維有利于NIH3T3細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)[7]。在此基礎(chǔ)之上，Rajzer等[8]通過微圖案化法將聚苯胺涂敷在成骨藥物改性的PCL和磷酸鈣(SG5)改性的明膠(Gel)的納米纖維表面，得到三層多孔納米纖維體系(圖1)。磷酸鈣納米顆粒和成骨藥物的存在能夠增強(qiáng)混合支架的生物活性，并且PANI存在并不會(huì)影響磷灰石在模擬體液中的形成，從而實(shí)現(xiàn)了成骨藥物、生物活性顆粒和導(dǎo)電聚合物的3種材料的協(xié)同作用，共同促進(jìn)了成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和支架材料的多功能化。

Chen等[9]采用一種新型的原位聚合熱誘導(dǎo)相分離(TIPS)法成功制備了分散性良好，孔隙率高于90%的PANI/PLA導(dǎo)電納米纖維支架材料，研究了不同PANI含量的導(dǎo)電納米纖維支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)生長(zhǎng)影響。結(jié)果表明，PANI含量為5%和10%時(shí)納米支架可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，超過15%時(shí)細(xì)胞活力下降；與PLA組相比，復(fù)合纖維支架培養(yǎng)的細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)水平、骨鈣素(Ocn)含量、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2)分化表達(dá)水平都增加數(shù)倍，說明導(dǎo)電復(fù)合支架能顯著促進(jìn)BMSCs的成骨分化；茜素紅染色說明導(dǎo)電復(fù)合納米纖維具有較好的鈣沉積作用，尤其是在PANI含量為10%時(shí)，支架染色陽性最為顯著。

圖1 三層多孔納米纖維的制備[8]Fig 1 Preparation of three layers porous nanofibers

1.2 核殼結(jié)構(gòu)聚苯胺可降解聚合物

導(dǎo)電核殼結(jié)構(gòu)納米纖維在組織工程等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景，尤其是當(dāng)與生長(zhǎng)因子、ECM蛋白和其他類型的功能分子被整合到導(dǎo)電聚合物殼內(nèi)或在其表面偶聯(lián)，可以進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞在納米纖維的支架上生長(zhǎng)[10-11]。因此，許多學(xué)者利用核殼結(jié)構(gòu)的導(dǎo)電聚苯胺可降解聚合物支架培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行生物學(xué)表征。

T.Paula等[12]將十二烷基苯磺酸(DBSA)摻雜的PANI以不同比例與PLA/PEG相互混合，采用同軸靜電紡絲得到了核殼結(jié)構(gòu)納米纖維。PLA/PEG外殼包覆后減少了PANI的釋放，降低了復(fù)合纖維生物毒性；觀察小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明，5%PANI/PLA/PEG為心肌細(xì)胞提供了非常好的附著力，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀和方向，不會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞的搏動(dòng)和收縮功能的發(fā)育產(chǎn)生干擾或阻礙，表現(xiàn)出良好的生物相容性。

Zhang等[13]采用同軸靜電紡絲法制備了以神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)為核，PANI與聚乳酸共聚己內(nèi)酯/絲素蛋白混合物的共混體系(PS)為殼的納米纖維，探討電刺激與NGF對(duì)神經(jīng)元生長(zhǎng)的協(xié)同作用。結(jié)果表明，隨著PANI濃度的增加，纖維直徑減小，接觸角和楊氏模量降低，電導(dǎo)率增加；從細(xì)胞活性和形態(tài)學(xué)來看，載NGF的PS-PANI納米纖維可以促進(jìn)小鼠雪旺細(xì)胞增長(zhǎng)，引導(dǎo)細(xì)胞定向生長(zhǎng)，電刺激下可以有效支持大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤12(PC12)神經(jīng)突的生長(zhǎng)，增加神經(jīng)突承載細(xì)胞的比例和中位神經(jīng)突長(zhǎng)度，并且可以增加導(dǎo)電核殼結(jié)構(gòu)納米纖維中NGF的釋放。

1.3 摻雜聚苯胺可降解聚合物

聚苯胺作為生物材料溶解性差、不易降解等局限性，與可降解聚合物共混或復(fù)合后的支架在溶解性和導(dǎo)電性方面不盡如人意。采用側(cè)基功能化或酸摻雜可以明顯改善PANI的溶解性和導(dǎo)電性，實(shí)現(xiàn)聚苯胺基可降解聚合物支架在電刺激下導(dǎo)電性、可降解性和生物相容性相互協(xié)調(diào)作用。

Min等[14]通過調(diào)整苯胺(AN)和甲苯胺酸(MA)兩種單體的配比，合成了一系列不同磺化度的聚苯胺(SPAN)。結(jié)果表明，隨著磺化度增加，電導(dǎo)率下降；SPAN直接與人骨肉瘤(HOS)細(xì)胞接觸時(shí)，顯示出良好的生物相容性。在此基礎(chǔ)之上，將得到的SPAN制備為交叉電極(圖2)，研究在電刺激作用下對(duì)HOS細(xì)胞的影響[15]。結(jié)果表明：SPAN磺化度越高，細(xì)胞的跨徑電導(dǎo)率越高，可在不受電刺激的情況下促進(jìn)細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)；在低電壓和低頻率(800 mV和1 kHz)刺激下，可增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)；當(dāng)電壓或頻率超過一定水平，細(xì)胞生長(zhǎng)超過最大閾值，會(huì)發(fā)生明顯死亡。進(jìn)一步地，研究電刺激下SPAN交叉電極對(duì)BMSCs和MC3T3-E1細(xì)胞相容性和增殖的影響[16]。所制備的SPAN在較廣的pH范圍下，具有較高導(dǎo)電性和穩(wěn)定性；采用ALP活性測(cè)定法和細(xì)胞染色皆證實(shí)對(duì)兩種細(xì)胞的礦化程度顯著增加，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。因此，SPAN可成為體外細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程應(yīng)用的潛在支架材料。

圖2 SPAN交叉電極制備[15]Fig 2 Preparation of sulfonated polyaniline-based interdigitatedelectrodes[15]

十二烷基苯磺酸(DBSA)是最常用的摻雜劑，能有效提高產(chǎn)品的分散性、溶解性和導(dǎo)電性。Yan等[17]將苯胺單體、乳化劑和摻雜劑DBSA在水中混合，以各種氧化劑進(jìn)行乳液聚合，形成DBSA-PANI/PLA復(fù)合溶液，靜電紡絲為復(fù)合納米纖維膜。實(shí)驗(yàn)得到的PANI/PLA纖維膜電導(dǎo)率較高，纖維膜的電導(dǎo)率最高達(dá)9.1×10-3S/cm，可作為生物材料應(yīng)用于電刺激生物組織工程領(lǐng)域。

Li等[18]將樟腦磺酸(CPSA)摻雜后的聚苯胺(C-PANI)與明膠共混后靜電紡絲纖維，經(jīng)0.2%的EDC交聯(lián)后得到了均相的多孔納米纖維，研究H9c2心肌成肌細(xì)胞在聚苯胺/明膠纖維上的黏附和分化。結(jié)果表明，CPSA改善了PANI的溶解度，隨著C-PANI含量的增加，支架的抗拉強(qiáng)度增加，導(dǎo)電率可提高4倍左右；H9c2細(xì)胞在電紡C-PANi/明膠共混纖維支架上呈現(xiàn)出更高的分化度，支持H9c2細(xì)胞的附著、遷移和增殖。此外，其他學(xué)者[19-20]將不同含量的CPSA摻雜PANI與PCL混合紡絲纖維支架，都可以提高表面電導(dǎo)率可使血清蛋白更有效地吸收和沉積，從而有利于細(xì)胞的附著和增殖。

2 苯胺寡聚體可降解聚合物

由于聚苯胺溶解性差，過量使用存在細(xì)胞毒性，需要控制其含量或者尋求一種溶解性好、易降解的材料替代。苯胺寡聚體的導(dǎo)電性與聚苯胺相近，具有低分子量、可溶性好等優(yōu)點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)導(dǎo)電可降解性聚合物提供了一種新選擇。目前在苯胺寡聚體方面的研究主要是采用嵌段共聚物、側(cè)鏈接枝和超支化的策略解決導(dǎo)電聚合物溶解性、生物降解性和導(dǎo)電性的問題。

2.1 嵌段共聚物

合成有苯胺寡聚體和可降解部分的多嵌段共聚物，是含羥基封端的導(dǎo)電低聚體與含羧基的可降解聚合物通過縮聚反應(yīng)得到的[21]。郎樂等[22]以二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)為縮合劑,將聚乙二醇單甲基醚(mPEG)與苯胺四聚體(AT)反應(yīng), 得到有良好的電活性二嵌段共聚物。羥基封端的聚乳酸(PLA)和羧基封端的苯胺五聚物(AP)通過酯化反應(yīng)縮聚為多嵌段共聚物PLAAP[23](圖3)，表現(xiàn)出很好的電活性、溶解性和生物可降解性，在電刺激的下PLAAP可促進(jìn)PC-12細(xì)胞分化。

圖3 PLAAP嵌段共聚物合成路線及結(jié)構(gòu)[23]Fig 3 Synthesis route and structure of PLAAP block copolymer

由于縮聚反應(yīng)需要多步聚合、純化繁瑣、產(chǎn)率低、殘留有毒溶劑，使得縮聚反應(yīng)合成多嵌段導(dǎo)電可降解聚合物有了許多的限制[24]。因此，研究人員引入有機(jī)金屬基的辛酸亞錫(Sn(Oct)2)催化劑[25-27]和酶催化脂肪酶[28-30]催化劑聚合反應(yīng)過程中，通過開環(huán)聚合(ROP)反應(yīng)將導(dǎo)電單元與可降解單元以酯基或酰胺基連接得到具有電活性和可降解性的共聚物支架用于組織工程領(lǐng)域。

郭保林團(tuán)隊(duì)[31-32]通過開環(huán)聚合和氧化偶聯(lián)兩步法合成了一系列嵌段苯胺低聚體可降解共聚物。合成的苯胺五聚體和聚己內(nèi)酯(PCL)組成的ABA型三嵌段共聚物(圖4)[33]，表現(xiàn)出分子量可控、優(yōu)良的電活性和生物可降解性。按照類似方法，劉四委等[34]合成了雙聚己內(nèi)酯封端苯胺三聚體ABA型三嵌段聚合物，其熱穩(wěn)定性和電化學(xué)穩(wěn)定性均表現(xiàn)良好，且對(duì)溶液pH值的響應(yīng)范圍更寬、更靈敏，更適用于體內(nèi)外支架材料的應(yīng)用。R. Sarvari等[35]合成了以D-葡萄糖為核的星狀聚己內(nèi)酯-聚苯胺共聚物(S-PCL-PANI),并與PCL共混后靜電紡絲得到三維多孔納米纖維(S-PCL-PANI /PCL)支架。所制備的支架孔隙率高、表面積大，導(dǎo)電性高(0.03 S/cm)，具有較高的生物相容性，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的附著、增殖和分化。

脂肪酶因其無毒環(huán)保、反應(yīng)效率高、反應(yīng)條件溫和、特異性高和反應(yīng)過程易于控制而被廣泛應(yīng)用[36]。與Sn(Oct)2基催化劑相比，脂肪酶開環(huán)聚合得到的導(dǎo)電可降解聚合物分子量集中在較低的水平，易于降解，電活性亦不受影響，具有良好的環(huán)境友好性和廣闊的應(yīng)用前景[37]。

2.2 側(cè)鏈接枝

劉四委等[38]將合成的不同長(zhǎng)度苯胺鏈段接枝到聚甲基丙烯酸類聚合物，發(fā)現(xiàn)當(dāng)苯胺鏈段達(dá)到一定長(zhǎng)度時(shí)，經(jīng)質(zhì)子酸摻雜后的聚合物具有一定的電導(dǎo)性。其中，接枝苯胺八聚體的共聚物經(jīng)質(zhì)子酸摻雜后其電導(dǎo)率可以達(dá)到10-5S/cm。郎樂等[39]以N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化的聚L-谷氨酸的羧基與苯胺四聚體的氨基縮合，得到了以可生物降解的聚谷氨酸為主鏈，具有電活性的苯胺四聚體為側(cè)鏈的新型接枝聚合物，接枝后的聚合物表現(xiàn)出良好的電化學(xué)活性和生物可降解性。

2.3 超支化

將合成的超支化延性聚乳酸(HPLA)與不同含量的苯胺四聚體(AT)共聚，得到了一系列電活性、延性和可降解的共聚物(HPLAAT)[40]。與HPLA相比，HPLAAT具有較高的電活性，表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性和可控的生物降解速率；在肌管形成過程中，能顯著提高C2C12成肌細(xì)胞的增殖；定量分析肌管數(shù)量、長(zhǎng)度、直徑、成熟指數(shù)以及對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)表明，HPLAAT可極大促進(jìn)C2C12細(xì)胞的成肌分化。B. Massoumi等[41]在之前工作基礎(chǔ)上[35]，合成了以聚酯為核的星狀超支化聚乳酸-聚苯胺的三元共聚物(S-HAP-PLA-PANI)并與PLA共混后靜電紡絲得到S-HAP-PLA-PANI/PLA納米纖維支架。復(fù)合纖維平均直徑為70～100 nm，在體外環(huán)境12周后支架質(zhì)量損失45%；導(dǎo)電率為0.05 S/cm，具有良好的生物相容性，可以模仿細(xì)胞外基質(zhì)的自然微環(huán)境調(diào)節(jié)細(xì)胞依附、增殖和分化。

圖4 三嵌段PCL-EMAP-PCL合成路線[33]Fig 4 Synthesis route ofthree-block PCL-EMAP-PCLcopolymer

3 結(jié) 語

聚苯胺基導(dǎo)電可降解聚合物支架因其高電活性、生物相容性和可降解性優(yōu)勢(shì)成為組織工程發(fā)展的一種趨勢(shì)，電刺激下并且在可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、增值和分化。酶催化劑的引入使其制備條件溫和、過程可控和環(huán)保，基于苯胺寡聚體的超支化的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)在滿足導(dǎo)電性和可降解性的前提下表現(xiàn)出更好的生物活性和生物相容性。酶催化與超支化分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的結(jié)合將是聚苯胺基導(dǎo)電可降解聚合物研究方向，優(yōu)異的生物學(xué)性能在組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。