李松巖，林冬靜，于 洋，劉師兵，徐 路，孫 奇，徐 冶

(1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤靶向治療與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013；2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013)

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一[1-2]，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率占各類婦科惡性腫瘤的首位[3-5]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然的多酚類化合物，其抗腫瘤作用已經(jīng)得到確認(rèn)[6-7]。沉默信息調(diào)節(jié)因子3 (silent mating type information regulation 3，Sirt3)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的Ⅲ類去乙?；福湓诰€粒體的適應(yīng)性反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用[8]。研究[9-11]表明：Sirt3影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)Sirt3基因缺失時(shí)，可以增加細(xì)胞的糖酵解過程，促進(jìn)腫瘤的生長。Sirt3也可影響基因組，抑制癌癥相關(guān)代謝和影響腫瘤微環(huán)境，在癌癥的發(fā)展過程中發(fā)揮不同的作用[12-13]。研究[14-15]顯示：Res可以通過調(diào)節(jié)Sirt3表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的功能。為了明確Res對SKOV3細(xì)胞的促凋亡作用，本研究采用Sirt3抑制劑3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶[3-(1H-1,2,3-triazol-4-yl) pyridine, 3-TYP]抑制Sirt3表達(dá)后，探討Sirt3在Res誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究Res的抗腫瘤作用及其在臨床中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞由吉林醫(yī)藥學(xué)院腫瘤靶向治療與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。Res購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，溶于DMSO中，4℃保存。MTT和DMSO購自Sigma公司，Hoechst 33342熒光染料購自北京鼎國公司，活性氧(ROS)熒光探針-DHE購自北京索萊寶生物科技有限公司，兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)和β-actin單克隆抗體及含有辣根過氧化物酶的羊抗兔二抗均購自長春德爾塔生物有限公司，3-TYP購自上海陶術(shù)生物科技有限公司。恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，電子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司)，超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾公司)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國Hermle公司)，倒置光學(xué)顯微鏡(日本Leica公司)，水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Model-680型酶標(biāo)儀、蛋白電泳儀和蛋白轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-rad公司)，脫色搖床(北京六一醫(yī)學(xué)儀器廠)，超聲細(xì)胞粉碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)，高溫高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 MTT法檢測SKOV3細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中。Res用DMSO溶解后，用不同濃度(0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0和80.0 mg·L-1)Res處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT(5 mg·L-1)20 μL，4 h后棄去含有MTT的培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL。用酶標(biāo)儀在490 nm處 檢測每孔吸光度(A)值。每次檢測重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.3 MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖抑制率 取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中。3-TYP用DMSO溶解后，稀釋成相應(yīng)濃度。將細(xì)胞分為對照組、3-TYP(50 μmol·L-1)組、Res(30 mg·L-1)組和3-TYP+Res組，孵育24 h后，每孔加入MTT20 μL，4 h后棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL。用酶標(biāo)儀檢測每孔A值，每次檢測重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/空白組A值)×100%。

1.4 Hoechst 33342染色觀察SKOV3細(xì)胞核形態(tài) SKOV3細(xì)胞以1×105mL-1密度接種于24孔板，分組同上，24 h后用PBS洗滌3次，每孔加入4%多聚甲醛200 μL固定25 min，用PBS洗滌3次，加入200 μL Hoechst 33342熒光染料染色5 min，PBS洗滌3次，用甘油封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察SKOV3細(xì)胞核形態(tài)。

1.5 ROS探針檢測SKOV3細(xì)胞中ROS水平 細(xì)胞分組同上，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入PBS 500 mL洗滌3次，加入用RPIM 1640培養(yǎng)液稀釋的ROS探針(1∶2 500)孵育20 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察探針顯色情況。以紅色熒光強(qiáng)度表示ROS水平。

1.6 Western blotting法檢測SKOV3細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞分組同上，培養(yǎng)24 h, 收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入蛋白裂解液RIPA 150 μL，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞后，冰上放置30 min，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)離心，收集上清。BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，PBST洗滌3次，用Sirt3抗體(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶2 000)、Bax抗體(1∶2 000)、cleave caspase-3抗體(1∶500)和β-actin抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。次日PBST洗滌3次，用HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，PBST洗滌5次，ECL顯色液顯色。以β-actin作為內(nèi)參照，采用Quantity One軟件對結(jié)果進(jìn)行分析處理，并計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測SKOV3細(xì)胞存活率 不同濃度Res處理SKOV3細(xì)胞24 h后，隨著Res濃度的增高，細(xì)胞存活率明顯降低，Res的半數(shù)抑制濃度(IC50)為42.73 mg·L-1。見圖1。

圖1 MTT法檢測SKOV3細(xì)胞存活率Fig.1 Survival rates of SKOV3 cells detected by MTT method

2.2 各組細(xì)胞增殖抑制率和Hoechst 33342染色結(jié)果 與對照組(0.00%±1.37%)比較，Res組和3-TYP+Res組細(xì)胞增殖抑制率(0.26%±0.06%和0.47%±0.09%)明顯升高(P<0.05)；與Res組比較，3-TYP+Res組細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)一步升高(P<0.05)。應(yīng)用Hoechst 33342染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察SKOV3細(xì)胞核形態(tài)表現(xiàn)：3-TYP+Res組細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、染色增強(qiáng)、核碎裂增多，其余各組只有個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)類似現(xiàn)象。見圖2(插頁三)。

A：Control group；B：3-TYP group；C：Res group；D：3-TYP+Res group.
圖2 各組SKOV3細(xì)胞核形態(tài)表現(xiàn)(Hoechst 33342,×400)
Fig.2 Morphology of SKOV3 cell nuclei in various groups (Hoechst 33342,×400)

2.3 各組細(xì)胞中ROS水平 以ROS熒光探針-DHE進(jìn)行染色，紅色熒光強(qiáng)度代表ROS水平，激光共聚焦顯微鏡下觀察。與對照組比較，3-TYP組細(xì)胞紅色熒光無明顯變化，Res組和3-TYP+Res組細(xì)胞紅色熒光明顯減少。見圖3(插頁三)。

A-D:ROS；E-H:Bright field; A,E：Control group；B,F：3-TYP group；C,G：Res group；D,H：3-TYP+Res group.
圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察各組SKOV3細(xì)胞中熒光強(qiáng)度(×400)
Fig.3 Fluorescence intensities in SKOV3 cells in various groups detected by laser confocal microscope(×400)

2.4 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與對照組比較，3-TYP組細(xì)胞中Sirt3蛋白表達(dá)水平明顯降低(t=-5.37，P<0.05)，Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)；Res組細(xì)胞中Sirt3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低(t=-8.71，P<0.05；t=-4.67，P<0.05)，Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(t=3.64，P<0.05；t=5.72，P<0.05)；與Res組比較，3-TYP+Res組細(xì)胞中Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(t=8.47，P<0.05；t=4.29，P<0.05)，Bcl-2和Sirt3蛋白表達(dá)水平明顯降低(t=-10.52，P<0.05；t=-7.61，P<0.05)。見圖4和表1。

Lane 1：Control group；Lane 2：3-TYP group；Lane 3：Res group；Lane 4：3-TYP+Res group.
圖4 Western blotting法檢測各組SKOV3細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖
Fig.4 Electrophoregram of expressions of apoptosis-related proteins in SKOV3 cells in various groups detected by Western blotting method

表1 各組SKOV3細(xì)胞中Sirt3、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of Sirt3，Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in SKOV3 cells in various groups

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with Res group.

3 討 論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過程，其對一些婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展均可產(chǎn)生影響[16]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是最理想的治療腫瘤的策略[17]。已有研究[18-19]證明：Res能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，包括白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌和食道癌等。本研究結(jié)果表明：Res作用SKOV3細(xì)胞后，細(xì)胞存活率下降，且呈濃度依賴性，與已報(bào)道結(jié)果一致[9]。為進(jìn)一步研究Res誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本文作者用Sirt3抑制劑3-TYP作用于SKOV3細(xì)胞，進(jìn)一步觀察Res對SKOV3細(xì)胞影響的結(jié)果顯示：與Res組比較， 3-TYP+Res組SKOV3細(xì)胞生長抑制率明顯升高，并且Hoechst 33342染色顯示細(xì)胞核染色增強(qiáng)、核碎裂明顯增多，表明應(yīng)用3-TYP抑制Sirt3表達(dá)后，可增強(qiáng)Res對SKOV3細(xì)胞的抑制作用。研究[20]表明：線粒體中的Sirt3可以激活超氧化物歧化酶含錳金屬輔基(MnSOD)和異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)，防止ROS在線粒體中積累。而Res又具有明顯的抗氧化、抗自由基和抗癌等功效[21]，因此Sirt3可能通過ROS影響Res對SKOV3的作用。本研究結(jié)果顯示：與對照組比較，Res組SKOV3細(xì)胞中ROS水平降低，而3-TYP+Res組SKOV3細(xì)胞中ROS水平進(jìn)一步降低，表明Sirt3通過細(xì)胞中ROS影響Res對SKOV3細(xì)胞的抑制作用。細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中，Bcl-2家族起關(guān)鍵作用[20,22]。本研究結(jié)果顯示：與Res組比較，3-TYP和Res聯(lián)合作用SKOV3細(xì)胞24 h后，凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2和 Sirt3蛋白表達(dá)水平明顯降低，可能是抑制Sirt3后導(dǎo)致線粒體內(nèi)ROS改變，進(jìn)而使Res抗氧化能力的增強(qiáng)，SKOV3細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑被激活。

綜上所述，Res誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的作用的機(jī)制可能是通過內(nèi)源性線粒體途徑激活Bcl-2家族，進(jìn)而激活caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Res可能通過Sirt3-ROS-Bcl-2通路誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡。Sirt3能夠協(xié)同Res增強(qiáng)細(xì)胞凋亡作用，但其最終能否成為治療腫瘤的一個(gè)新的途徑還需進(jìn)一步研究。