謝金芳，孟 琳，高華麗，李雪洋，胡 雪，張穎麗，尹 碩

(1.吉林大學口腔醫(yī)院綜合口腔治療科， 吉林 長春 130021； 2. 吉林大學口腔醫(yī)院病理科， 吉林 長春 130021；3. 吉林大學口腔醫(yī)院牙體牙髓科， 吉林 長春 130021；4.吉林省長春市口腔醫(yī)院修復科， 吉林 長春 130022)

牙本質與牙髓一起構成牙髓-牙本質復合體，在保護和滋養(yǎng)整個牙齒方面起著至關重要的作用。牙髓-牙本質復合體的活力極大地影響牙齒的存活和預后[1-2]。一方面，完整的牙本質為牙髓提供了相對封閉的環(huán)境，保護牙髓免受細菌侵入和其他物理或化學刺激。當牙本質受損時，刺激物可通過牙本質小管或暴露的牙髓引發(fā)牙髓炎癥。另一方面，牙髓可通過成牙本質細胞和細胞突提供氧氣、營養(yǎng)物質以及牙本質液來維持牙本質的活力，以保持其礦化程度。齲病、創(chuàng)傷和醫(yī)源性損傷均可使牙本質損傷甚至牙髓暴露，導致牙齒支撐力降低、牙髓炎、牙髓壞死，最終可能導致牙齒折裂甚至牙齒脫落[3]。因此，在牙髓暴露的處理中，牙本質再生和牙髓活力保持尤為關鍵[4]。

Matrilin-4是非膠原性細胞外基質蛋白家族的一員。研究[5]顯示：Matrilin-4在健康牙髓組織成牙本質細胞層呈陽性表達，而在深齲牙髓組織中，在齲損下方的成牙本質細胞層及相鄰牙髓細胞中可見其陽性表達。推測Matrilin-4可能是牙髓干細胞向成牙本質細胞分化的標志，可能與修復性牙本質的形成有關[6-7]，但將Matrilin-4作為蓋髓劑應用于大鼠牙齒的治療尚未見報道。本研究通過構建大鼠牙髓機械性損傷的模型，將Matrilin-4作為蓋髓劑置于牙髓暴露斷面，以牙本質涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)作為修復性牙本質形成的特異性標志物[8],觀察Matrilin-4蓋髓后成牙本質細胞中DSP的表達情況,探討Matrilin-4在修復性牙本質形成過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 8周齡清潔級雄性Wistar大鼠28只，體質量180～220 g，吉林大學動物中心提供,動物許可證號：SCXK(吉)2015-0001。水合氯醛、EDTA溶液、4%多聚甲醛和生理鹽水(北京恒業(yè)中遠化工有限公司)，DSP多克隆抗體(英國Biorbyt公司)，EDTA抗原修復液、兔S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)。膠原蛋白海綿(吉林大學口腔頜面外科提供)，富士Ⅸ玻璃離子(吉林大學口腔醫(yī)院提供)，Matrilin-4(美國Sigma公司)。1/4 鎢鋼球鉆和高速渦輪機(上海醫(yī)用器械設備廠)，BX71顯微鏡和照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)，自制開口器。

1.2 實驗動物分組和標本制備 28只Wistar大鼠稱體質量,適應性飼養(yǎng)1周后,用3%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.5 mL·kg-1)，仰臥位，固定四肢于手術板上。2% 碘伏溶液消毒口腔，分別于每只大鼠雙側上頜第一磨牙用1/4球鉆在頜面中央備洞，透粉時停止操作，探針穿髓，生理鹽水沖洗。無菌棉球壓迫止血并干燥窩洞后,左側露髓處放置含Matrilin-4的膠原蛋白海綿(Matrilin-4組)，右側露髓處放置含PBS的膠原蛋白海綿蓋髓(PBS組)，雙側均用玻璃離子充填窩洞。以上所有操作均由同一名臨床經驗豐富的醫(yī)生獨立完成。分別于蓋髓術后 3、7、14和28 d心臟灌流固定處死大鼠各7只，迅速分離各大鼠的上頜骨并制備包含雙側上頜第一磨牙的骨組織塊。然后將各組骨組織塊置于新配置的4%多聚甲醛中,常溫固定48 h后置于100 g·L-1EDTA(pH值為7.4)溶液中脫鈣12周。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋后,平行于牙體長軸方向行近、遠中向連續(xù)切片(厚度為5 μm)。

1.3 HE 染色觀察大鼠牙髓組織形態(tài)表現(xiàn) 取上述各組大鼠牙體組織切片常規(guī)脫蠟至水,分別經蘇木素染色10 min，流水沖洗；1%鹽酸乙醇分化1～3 s，流水沖洗；氨水返藍5～10 s，0.5%伊紅溶液染色5 min，流水沖洗 5 min；梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察各組大鼠修復性牙本質的形成情況并采集圖像。

1.4 免疫組織化學染色檢測大鼠牙本質細胞中DSP陽性表達強度 取上述各組大鼠組織切片脫蠟至水,用PBS洗滌并擦干組織周圍的多余水分后,微波抗原修復后自然冷卻30 min后流水沖洗冷卻至室溫，PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次;滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育15 min，傾去血清,不洗；滴加稀釋的DSP抗體(1∶100), 4℃濕盒過夜;次日37℃復溫 45 min,PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加生物素標記山羊抗兔IgG室溫孵育15 min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15min，PBS緩沖液沖洗3 min×3次；DAB顯色；蘇木素輕度復染3 min、流水沖洗、分化、返藍、梯度乙醇水化后、二甲苯透明、中性樹膠封片；顯微鏡下觀察DSP表達情況并拍照。在高倍鏡下從每張切片的DSP染色陽性區(qū)各隨機選取3個不重疊區(qū)域,用Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測其陽性區(qū)的吸光度(A)值,取均值代表DSP陽性表達強度。

2 結 果

2.1 各組大鼠牙髓組織HE 染色結果 3 d時，PBS組大鼠穿髓孔下方有炎癥細胞聚集，并可見擴張的血管，穿髓處散在分布牙本質碎屑；Matrilin-4組大鼠牙體組織穿髓孔下方有少量炎癥細胞聚集,并可見明顯擴張的血管，未見明顯的前期牙本質形成。7 d時，PBS組大鼠穿髓孔下方炎癥反應加重，大量炎癥細胞聚集并向髓腔方向浸潤，可見少量前期牙本質形成；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方炎癥反應較3 d時加重，血管擴張明顯，成牙本質細胞層及牙本質之間可見前期牙本質。14 d時，PBS組大鼠穿髓孔下方炎癥細胞密集及纖維組織增生，可見前期牙本質不均勻增厚而形成修復性牙本質，但未封閉暴露的牙髓組織；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方可見較連續(xù)完整的修復性牙本質橋形成，覆蓋露髓區(qū)域，但修復性牙本質橋之間可見隧道缺陷，牙髓組織中無明顯炎細胞浸潤。28 d時，PBS組大鼠穿髓孔下方可見一定量修復性牙本質形成，髓室內大量炎癥細胞浸潤呈變性壞死表現(xiàn) ；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方連續(xù)完整的修復性牙本質橋較14 d時增厚，牙本質橋下面有重組的成牙本質細胞層，無明顯炎癥細胞浸潤，牙髓形態(tài)正常。見圖1(插頁五)。

A-D: PBS group； E-H: Matrilin-4 group; A,E: 3 d; B,F: 7 d; C,G: 14 d; D,H: 28 d.
圖1 不同時間各組大鼠牙髓組織形態(tài)表現(xiàn)(HE，×200)
Fig.1 Morphology of pulp tissue of rats in various groups at different time(HE，×200)

2.2 各組大鼠成牙本質細胞中DSP陽性表達強度 3 d時，PBS組大鼠穿髓孔下方的成牙本質細胞無明顯DSP陽性表達；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方的成牙本質細胞DSP呈弱陽性表達。7 d時，PBS組大鼠穿髓孔下方的成牙本質細胞DSP呈弱陽性表達；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方的成牙本質細胞DSP呈陽性表達，強度高于3 d時。14 d時，PBS組大鼠穿髓孔下方的成牙本質細胞DSP呈陽性表達,但其強度較同時段Matrilin-4組弱；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方的成牙本質細胞DSP呈強陽性表達，此時陽性表達達高峰。28 d時，PBS組大鼠穿髓孔下方的成牙本質細胞DSP呈弱陽性表達，其強度較同時段Matrilin-4組弱；Matrilin-4組大鼠穿髓孔下方的成牙本質細胞DSP呈弱陽性表達。見圖2(插頁五)。

A-D: PBS group ；E-H: Matrilin-4 group; A,E: 3 d; B,F: 7 d; C,G: 14 d; D,H: 28 d.
圖2 不同時間各組大鼠成牙本質細胞中DSP表達情況(免疫組織化學， ×200)
Fig.2 Expressions of DSP in odontoblasts of rats in various groups at different time(Immunohistochemistry,×200)

與PBS組比較, 實驗 3、7和14 d時Matrilin-4組大鼠牙髓組織中DSP陽性表達強度明顯升高(P<0.01)，28 d 時差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

3 討 論

牙髓作為牙組織中唯一的軟組織，具有形成、營養(yǎng)、感覺和防御功能，其對維持牙體組織的強度發(fā)揮重要的作用。外傷性或機械性刺激等均可造成牙髓暴露，不能及時有效的治療終將導致牙髓感染、壞死甚至根尖周炎等不可逆性損傷。一旦牙髓壞死，牙本質就無法獲得供應并逐漸變脆，從而導

表1 不同時間各組大鼠成牙本質細胞中DSP陽性表達強度Tab.1 Positive expression strengths of DSP in odontoblasts in two groups at different time

*P<0.01 compared with PBS group.

致牙齒折裂或牙冠變色[9]。尤其對根尖未發(fā)育完成的年輕恒牙，保存其牙髓活性可促進牙根繼續(xù)發(fā)育及生理性牙本質的形成[10]。直接蓋髓術作為牙髓暴露的重要治療方法，需要對暴露的牙髓組織充分保護而不損傷其活力和功能[11-12]，并刺激牙髓細胞分化為成牙本質樣細胞，促進受損的牙髓愈合及形成修復性牙本質[13]。氫氧化鈣作為最常用的蓋髓劑，可成功誘導硬組織屏障和反應性牙本質形成[4]，但其修復性牙本質橋可出現(xiàn)明顯的隧道缺陷，滲透性差，易受細菌重新定植，最終可能導致牙髓治療失敗[14]。三氧化鈣無機聚合物(mineral trioxide aggregate, MTA)因其良好的封閉性及生物性能成為近年來被廣泛應用于活髓保存治療中[15]，但其臨床操作較困難且治療后引起牙冠變色[16-20]。有研究[21]表明：MTA因釋放較高濃度有害金屬離子，具有潛在細胞毒性。Marilin-4廣泛分布于疏松和致密結締組織、皮膚、消化道上皮組織、骨、軟骨、血管壁和神經系統(tǒng)[7]，新生小鼠切牙始基、人牙髓細胞和深齲成牙本質細胞中也存在Matrilin-4的表達[8]。推測Marilin-4可能與牙本質形成有關，本實驗將Marilin-4作為蓋髓劑用于大鼠機械性牙髓損傷的治療,并以 PBS作為對照,觀察Marilin-4及PBS蓋髓后牙髓組織的炎癥反應、修復性牙本質的形成及成牙本質細胞中DSP的表達情況,以探討Marilin-4作為新型蓋髓劑的可行性。本研究中HE染色結果顯示:3 d時PBS組大鼠穿髓孔下方有炎癥細胞聚集及擴張的血管，7 d時穿髓孔下方炎癥反應加重且向髓腔方向浸潤,可見少量前期牙本質形成，14 d時可見修復性牙本質的形成，28 d時雖有一定量修復性牙本質形成，但髓室內大量炎癥細胞浸潤呈變性壞死表現(xiàn)；Matrilin-4組大鼠3 d時穿髓孔下方有少量炎癥細胞聚集,并可見明顯擴張的血管，14 d時穿髓孔下方可見連續(xù)完整的修復性牙本質橋形成,無明顯炎癥細胞浸潤。由此可推測Marilin-4具有一定的抗炎作用，可以促進血管再生及修復性牙本質的形成。本研究中免疫組織化學染色結果顯示：3 d時Marilin-4組大鼠成牙本質細胞中DSP呈弱陽性表達,隨后逐漸增強并于蓋髓后14 d達到最高峰， 28 d 時DSP陽性表達強度減弱，且蓋髓后各時間段DSP陽性表達均強于PBS組；與 PBS 組比較, Marilin-4組大鼠在 3、7、14 d 時DSP陽性表達強度明顯升高，術后 28 d 時DSP陽性表達強度差異無統(tǒng)計學意義。本研究結果提示：Marilin-4可增強成牙本質細胞和牙髓細胞的活躍性,調節(jié)成牙本質細胞樣細胞[22]，促進修復性牙本質的形成，推測Marilin-4可作為一種良好的蓋髓劑。

綜上所述, 將Marilin-4作為蓋髓劑用于大鼠機械性損傷的露髓處,在一定程度上可增強成牙本質細胞的活躍性并促進修復性牙本質的形成。Marilin-4可以作為一種良好的蓋髓劑,與氫氧化鈣和MTA等蓋髓劑聯(lián)合應用于臨床,改善現(xiàn)有的蓋髓劑的不足之處，本研究為開發(fā)新的蓋髓劑提供了理論依據(jù)。