李雪洋，尹 碩，謝金芳，李 晶，胡 雪，耿文韜，張穎麗

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科，吉林 長春 130021;2.吉林省長春市口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長春 130022)

牙外傷作為臨床上十分普遍的牙急性損傷， 多發(fā)生于年輕恒牙[1],而牙外傷中以牙脫位較為常見，此時青少年正處于生長發(fā)育期，根尖孔尚未完全閉合。牙脫位會帶來美學(xué)、功能和心理上的負(fù)擔(dān)，鑒于生物學(xué)和心理學(xué)上的支持[2]，國際牙外傷協(xié)會(IADT)指南建議即刻再植是治療牙脫位的最佳方法，同時該指南指出為了獲得牙髓血運重建和牙根的持續(xù)發(fā)育，對根尖孔開放的全脫位牙來說，除非有臨床或影像學(xué)證據(jù)顯示牙髓壞死，否則應(yīng)避免進行根管治療[3]。MELO等[4]研究表明：在理想的情況下，牙髓的血運重建和牙根的繼續(xù)發(fā)育是可能發(fā)生的，因此再植牙的牙髓治療并不適用于牙根尚未發(fā)育完全的牙齒。隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到牙髓細(xì)胞具有再生潛能，細(xì)胞遷移和血管新生在牙髓修復(fù)再生中均具有重要的作用[5-6]。因此，如何誘導(dǎo)牙髓組織內(nèi)血管新生以發(fā)揮牙髓的防御修復(fù)潛能，是牙髓修復(fù)再生和臨床活髓保存研究的重點。研究[7-10]顯示：促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)可通過募集基質(zhì)細(xì)胞至受損區(qū)域促進組織的再生修復(fù)，體內(nèi)外實驗也已證實EPO在腦缺血再灌注的保護、燒傷皮膚的愈合和股骨頭壞死修復(fù)中均發(fā)揮了促進血管新生的作用。目前對于再植牙的研究則大多集中于儲存介質(zhì)和牙周組織的愈合[11]，而EPO在再植牙牙髓修復(fù)方面的研究較少。因此本研究旨在探討EPO對再植牙牙髓血運重建的影響，為研究牙髓損傷的修復(fù)再生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 80只3周齡雄性Wistar大鼠購自吉林大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號:SCXF(吉)2015-0001，標(biāo)準(zhǔn)飼糧、隨機加水喂養(yǎng)，使其適應(yīng)環(huán)境1周，術(shù)前體質(zhì)量約100 g。EPO(沈陽三生制藥有限責(zé)任公司)，慶大霉素(上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司)，生理鹽水(遼寧民康藥業(yè)有限公司)， 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)抗體和SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒(武漢博士生物工程有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。雙目光學(xué)顯微鏡(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理教研室提供，配有日本QLYMPUS照相機)。Image Pro Plus 6.0(For windows)專業(yè)圖像分析軟件包，SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。

1.2 實驗動物分組和給藥 80只4周齡雄性Wistar大鼠隨機分為未拔牙組、陰性對照(生理鹽水)組、陽性藥對照(慶大霉素)組和EPO組，再根據(jù)觀察時間隨機分為3、7、14、21和28 d組。除外未拔牙組，其他3組大鼠固定后用30 g ·L-1水合氯醛(30 mL·kg-1體質(zhì)量)腹腔注射麻醉，顯效后用自制拔牙鉗完整拔出上頜第一磨牙，將拔出的牙齒置于無菌一次性器械盤中，分別在生理鹽水、慶大霉素和EPO溶液中浸泡4 min，再輕柔地植回牙槽窩內(nèi)，實現(xiàn)牙齒在5 min內(nèi)再植。牙再植術(shù)后嚴(yán)密觀察大鼠復(fù)蘇情況，自由飲水和攝食，每100 g飼料中混入阿莫西林0.5 g，療程為1周。

1.3 標(biāo)本采集和處理 分別在再植術(shù)后3、7、14、21和28 d取各組大鼠上頜第一磨牙及其周圍組織，用 4%多聚甲醛溶液4℃下固定24～48 h，于10%EDTA溶液中脫鈣12周，然后將標(biāo)本放入梯度乙醇中脫水，浸蠟，包埋，通過牙齒頰舌面沿牙齒長軸過根尖孔做厚度為3 μm的連續(xù)切片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色和HE染色 將石蠟切片放入烤箱中2 h，常規(guī)脫蠟水化，PBS沖洗后用3%雙氧水滅活10 min，PBS洗3次；再放入EDTA抗原修復(fù)液中進行高壓修復(fù)2 min，待冷卻至室溫時，PBS洗3次；隨后滴加5%BSA封閉液封閉30 min，滴加VEGF抗體過夜；隔天PBS洗3次后滴加二抗30 min，PBS沖洗后滴加SABC 30 min，PBS沖洗后滴加DAB顯示劑，顯微鏡下觀察反應(yīng)，終止后復(fù)染、分色、返藍和透明，中性樹脂封片，400倍顯微鏡下觀察拍照，觀察VEGF陽性表達情況，用Image Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件包測定上述切片中VEGF平均吸光度(AOD)值，代表VEGF蛋白表達水平。經(jīng)HE染色，中性樹脂封片，200倍顯微鏡下觀察再植牙的牙根發(fā)育情況。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色檢測各組大鼠牙體組織中VEGF蛋白表達 各組大鼠再植牙牙體組織中，成牙本質(zhì)細(xì)胞、前期牙本質(zhì)、血管內(nèi)皮細(xì)胞和牙髓細(xì)胞中VEGF蛋白呈陽性表達；與固有髓核比較，各組大鼠牙體組織中VEGF蛋白在成牙本質(zhì)細(xì)胞層陽性表達出現(xiàn)的時間較早且較強。與未拔牙組比較，其他3組大鼠再植牙牙體組織在3、7和14 d時 VEGF蛋白呈強陽性表達，隨著時間的推移，VEGF蛋白陽性表達強度逐漸減弱。與未拔牙組和生理鹽水組比較，慶大霉素組和EPO組大鼠再植牙牙體組織中VEGF蛋白的表達均較強。見圖1(插頁四)。

A-D:3 d;E-H:7 d;I-L:14 d;M-P:21 d;Q-T:28 d;A,E,L,M,Q:Non-tooth extraction group;B,F,J,N,R:Saline group;C,G,K,O,S:Gentamycin group;D,H,L,P,T:EPO group.
圖1 術(shù)后不同時間各組大鼠再植牙牙體組織中VEGF蛋白表達情況(免疫組織化學(xué)， ×400)
Fig.1 Expressions of VEGF protein in tooth tissue of replanted teeth of rats in various groups at different time after operation(Immunohistochemistry， ×400 )

2.2 各組大鼠再植牙牙體組織中VEGF蛋白表達水平 未拔牙組、生理鹽水組、慶大霉素組和EPO組大鼠再植牙牙體組織的AOD值從高到低依次為：EPO組>慶大霉素組>生理鹽水組>未拔牙組。與未拔牙組比較，3、7、14和21 d 時生理鹽水組、慶大霉素組和EPO組大鼠再植牙牙體組織中VEGF蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而28 d時各組大鼠再植牙牙體組織中VEGF蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與生理鹽水組比較，3、7、14和21 d時慶大霉素組和EPO組大鼠再植牙牙體組織VEGF蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，而在28 d時VEGF蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)； 與慶大霉素組比較，術(shù)后各時間點EPO組大鼠再植牙牙體組織中VEGF蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同時間點各組大鼠再植牙牙體組織中VEGF蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of VEGF protein in odontal tissue of replanted teeth of rats in various groups at different time points

*P<0.05vsnon-tooth extraction group;△P<0.05vsnormal saline group.

2.3 HE染色觀察各組大鼠再植牙牙髓血運重建情況 再植術(shù)后3 d，未拔牙組大鼠再植牙牙根持續(xù)發(fā)育，血運豐富；生理鹽水組大鼠再植牙可見炎癥浸潤灶；慶大霉素組大鼠再植牙纖維結(jié)締組織長入；與未拔牙組和生理鹽水組比較，EPO組大鼠再植牙血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管腔數(shù)目明顯增多。再植術(shù)后7 d，未拔牙組大鼠再植牙牙本質(zhì)增厚；生理鹽水組大鼠再植牙可見疏松結(jié)締組織長入；慶大霉素組大鼠再植牙血管腔增多；與未拔牙組比較，EPO組大鼠再植牙可見鈣化組織和修復(fù)性牙本質(zhì)；與生理鹽水組比較，慶大霉素組和EPO組大鼠再植牙的根尖孔均縮小。再植術(shù)后14 d，生理鹽水組大鼠再植牙血管充血擴張；慶大霉素組大鼠再植牙開始出現(xiàn)鈣化；與未拔牙組比較，EPO組大鼠再植牙髓腔內(nèi)出現(xiàn)類骨樣組織，牙本質(zhì)小管排列紊亂。再植術(shù)后21 d， 未拔牙組和EPO組大鼠再植牙根管壁持續(xù)增厚；生理鹽水組大鼠再植牙出現(xiàn)牙髓壞死；慶大霉素組大鼠再植牙可見牙骨質(zhì)和修復(fù)性牙本質(zhì)沉積，根尖孔縮小。 再植術(shù)后28 d， 未拔牙組和EPO組大鼠再植牙牙根逐漸發(fā)育成熟；生理鹽水組大鼠再植牙牙骨質(zhì)處可見骨吸收陷窩和破骨細(xì)胞，出現(xiàn)牙根吸收；慶大霉素組大鼠再植牙髓腔內(nèi)出現(xiàn)類骨樣組織。見圖2(插頁四)。

A-D:3 d;E-H:7 d;I-L:14 d;M-P:21 d;Q-T:28 d;A,E,I,M,Q:Non-tooth extraction group;B,F,J,N,R:Saline group;C,G,K,O,S:Gentamycin group;D,H,L,P,T:EPO group.
圖2 術(shù)后不同時間各組大鼠再植牙牙體組織形態(tài)表現(xiàn)(HE， ×200)
Fig.2 Morphology of tooth tissue of replanted teeth of rats in various groups at different time after operation(HE， ×200)

3 討 論

對于牙根未發(fā)育成熟的脫位牙，實現(xiàn)即刻再植或再植前儲存在合適的介質(zhì)中，牙髓血運重建是有可能發(fā)生的[3]。研究[12-13]表明：大鼠的上頜第一磨牙在15 d時牙根開始發(fā)育，25～30 d時牙根形成1/2～2/3，大鼠的切牙末端存在被稱為“apical bud”的特殊上皮結(jié)構(gòu)，使切牙得以終生不斷萌出。此外，有文獻[14-15]指出：牙髓血運重建通常在再植后30 d左右建立，且牙周膜的修復(fù)在28 d完成。因此本實驗選擇4周齡大鼠的第一磨牙進行了為期28 d的觀察，排除了個體自身發(fā)育的影響。

近年來研究者[16]發(fā)現(xiàn)了VEGF在人牙髓成纖維細(xì)胞中的表達。本研究結(jié)果顯示：無論是對照組還是實驗組，大鼠牙體組織中VEGF均呈陽性表達。還有研究[17]顯示：牙本質(zhì)基質(zhì)中含有VEGF，其在損傷后從牙本質(zhì)基質(zhì)中釋放，從而起到修復(fù)牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的作用。同時，成牙本質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)研究[18]表明：成牙本質(zhì)細(xì)胞可以上調(diào)VEGF的表達。在本研究中，與固有髓核比較，成牙本質(zhì)細(xì)胞層陽性表達出現(xiàn)的時間較早且陽性表達較強。

隨著對VEGF研究的深入，有學(xué)者[19]發(fā)現(xiàn)：EPO通過蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2/信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3(JAK2/ STAT3)信號通路上調(diào)VEGF的表達。本研究結(jié)果顯示：在再植術(shù)后3、7和14 d時EPO組和慶大霉素組大鼠再植牙牙體組織中VEGF均呈強陽性表達， 可能與該時間內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞變性、炎癥、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和分化、牙髓血運重建和修復(fù)性牙本質(zhì)形成活躍有關(guān)[5,15，20-21]； EPO組大鼠再植牙牙體組織中VEGF表達水平略強于慶大霉素組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測可能是因為在本實驗中實現(xiàn)了即刻再植，與現(xiàn)實條件比較，操作均在相對無菌的條件下進行，細(xì)菌污染程度相對較輕。體外研究[22]顯示：牙髓炎時，牙髓組織中EPO及其受體呈強陽性表達，表明EPO在炎癥牙髓中發(fā)揮著一定的作用。并且EPO除了抗炎作用外，還具有促進血管再生、神經(jīng)保護和促進成骨[7-10]的作用。最近的研究[23]表明：EPO通過促進Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素的表達以及促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)途徑上調(diào)人牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞和牙周炎間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力。但本研究選擇的是VEGF作為觀察指標(biāo)，而相關(guān)的研究[16]表明：VEGF的表達與牙髓炎中血管化的增加相一致，因此并不能說明EPO在增加再植牙成功率方面優(yōu)于慶大霉素，還需要長期的觀察和增加樣本量以及檢測細(xì)胞因子進行驗證，但根據(jù)慶大霉素組和EPO組大鼠再植牙牙體組織中VEGF蛋白表達水平均強于生理鹽水組和未拔牙組的結(jié)果推測，將VEGF和抗生素結(jié)合的微球作用于再植牙，可能會提高再植牙的遠期成活率，這將成為本課題組未來的研究方向。

綜上所述，本研究結(jié)果表明:EPO對再植牙的牙髓血運重建起到了一定的促進作用。