徐 騰 陳 云 楊 鑫 覃 堯 何曉濤 韓蒙蒙 楊雨輝

（海南大學動物科技學院 海南省熱帶動物繁育與疾病研究重點實驗室，海南海口570228）

熱應激會嚴重影響雞的生長[1-2]，破壞機體重要組織器官，尤其是對心肌組織的損傷更為顯著[3]，并導致雞因心力衰竭而應激性猝死[4]。研究表明，熱應激狀態(tài)下雞的心肌細胞會出現(xiàn)嚴重的顆粒變性，出現(xiàn)空泡，核固縮甚至核碎裂[5]。張曉輝[6]研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林通過誘導Hsp90表達有效抵抗體內外雞心肌細胞熱應激病理損傷。因此，探尋合適的藥物來減緩熱應激對心臟組織的損傷尤為關鍵。蟛蜞菊（Wedelia chinensis）為菊科多年生草本植物，味微苦、甘、性涼，具有清熱、解毒、消炎、止咳、抗癌等功效[7]。Darah等[8]研究者發(fā)現(xiàn)，蟛蜞菊甲醇提物可以有效地抑制蠟樣芽孢桿菌的生長作用。Huang等[9]研究發(fā)現(xiàn)在蟛蜞菊中提取的萜類化合物具有有效的抗血管生成活性。何仁春等[10]在鵝的日糧中加入蟛蜞菊可以有效提升鵝的生產性能和養(yǎng)分利用率，但蟛蜞菊提取物能否緩解雞因熱應激所導致的心肌組織損傷目前還未見報道。因此本試驗通過構建文昌雞胚原代心肌細胞體外模型，探究蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞抗熱應激的保護作用，為后續(xù)開發(fā)蟛蜞菊作為中藥飼料添加劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗藥物：蟛蜞菊，采自海南省?？谑兄苓?。

試驗種蛋：購自海南省某文昌雞孵化場。

DMEM/F12 培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清（Hyclone）；100 倍青鏈霉素溶液（Gibco）；9 膠原酶Ⅱ（Sigma）；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu，Sigma）；噻唑藍（MTT，Biosharp）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成）；谷草轉氨酶（AST）試劑盒（南京建成）；BCA蛋白濃度試劑盒（南京建成）；DMSO 溶液（Biotopped）；RIPA裂解液（碧云天）；苯甲基磺酰氟（PMSF，碧云天）；Hsp70小鼠單克隆抗體（Abcam）；GAPDH單克隆抗體（上海生工）；HRT標記的山羊抗小鼠抗體（上海生工）。

1.2 試驗主要儀器

旋轉蒸發(fā)儀（BUCHI）；低溫高速冷凍離心機（Eppendorf）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（HealForce）；潔凈工作臺（蘇潔凈化）；生物倒置顯微鏡（Motic）；酶標儀（Thermo）；微量振蕩器（江蘇新康醫(yī)療）；恒溫水浴鍋（江蘇金怡）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蟛蜞菊醇提物的制備

采用水浴輔助醇提法[11]提取蟛蜞菊醇提物。將蟛蜞菊莖葉用蒸餾水洗凈后，放置于60 ℃的烘箱中烘干并粉碎過40目篩。取10 g粉末與100 ml 95%乙醇（固液比為1∶10），60 ℃水浴30 min，抽濾，收集濾液；回收濾渣，再加入100 ml 95%乙醇，重復操作3次，合并濾液。旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏，加入DMSO溶解得到1 g/ml 母液。用DMEM/F12 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度（DMSO 終濃度≤0.1%）。

1.3.2 原代雞胚心肌細胞的提取與培養(yǎng)

參考魏宗波等[12]和Gao 等[13]的方法，取12 胚齡文昌雞胚心臟，用D-Hank's 洗滌并剪碎至1 mm3大小。加入0.12%膠原酶Ⅱ溶液并37 ℃水浴消化8 min，吸取上清液經過四層紗布后加入細胞培養(yǎng)液終止消化，棄去第一次消化液，重復上述至無明顯組織塊為止。將全部細胞懸液900 r/min離心6 min，棄上清，用培養(yǎng)液重懸沉淀并接種于培養(yǎng)皿放置在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱差速貼壁1.5～2 h。取細胞懸液用0.1 mM Brdu的培養(yǎng)液稀釋至相應濃度，放置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱待48 h后換正常培養(yǎng)液。

1.3.3 蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞活性檢測

采用MTT法測定不同濃度的蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞活性的影響。將細胞密度為1×104個/ml的細胞懸液接種到96孔板中，在分離純化后，分別加入0、0.05、0.5、5、50 μg/ml蟛蜞菊醇提物培養(yǎng)液，每個濃度設置4個重復孔。將細胞放置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），待培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，再加入150 μl DMSO，酶標儀570 nm波長下測定各孔的吸光值。

1.3.4 蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞抗熱應激活性檢測

采用MTT法測定不同濃度蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞減緩熱應激損傷的保護作用。將細胞密度為1×104個/ml的細胞懸液接種到96孔板中，在分離純化后，將細胞分為熱應激組與常溫組：加入0、1.25、5、20 μg/ml蟛蜞菊醇提物培養(yǎng)液，每個濃度設置4個重復孔。熱應激組將細胞板放置于45 ℃培養(yǎng)箱中處理4 h；常溫組放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），待培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，再加入150 μl DMSO，酶標儀570 nm波長下測定各孔的吸光值。

1.3.5 谷草轉氨酶(AST)和乳酸脫氫酶（LDH）含量測定

收集經熱應激和常溫處理后的細胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書進行操作檢測。

1.3.6 Hsp70蛋白表達含量測定

將細胞分為熱應激組（加入0、1.25、5、20 μg/ml蟛蜞菊醇提物）和空白常溫組。使用含有1%PMSF的RIPA 裂解液提取總蛋白，使用BCA 試劑盒測量總蛋白的濃度。然后采用Western Blot 技術檢測細胞內Hsp70蛋白表達。將蛋白樣品與SDS-loding Buffer 充分混勻后，煮沸變性10 min，-20 ℃下儲存。在SDSPAGE電泳后，100 V電轉90 min將蛋白轉印至PVDF膜上。取轉印好的PVDF 膜放置于含有5%脫脂奶粉的PBST 溶液中室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，顯影并使用Gel-Pro Analyzer 對膜上的條帶進行灰度定量分析。

1.3.7 數據統(tǒng)計分析

運用SPSS23.0統(tǒng)計軟件分析數據，采用單因素方差分析（ANOVA），分析各組間差異的顯著性，其中用“**”表示為P＜0.01 極顯著差異，用“*”表示為P＜0.05顯著差異。

2 結果與分析

2.1 文昌雞胚原代心肌細胞的形態(tài)學觀察

經消化后的原代雞胚心肌細胞大多數呈圓形并懸浮于細胞培養(yǎng)液中，如圖1中A所示。純化培養(yǎng)48 h后，細胞基本上都已經貼壁伸展，伸出偽足并呈現(xiàn)梭形，同時細胞出現(xiàn)節(jié)律性自發(fā)搏動，如圖1中B 所示。熱應激處理4 h后，細胞開始出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，胞漿中出現(xiàn)大量細小的空泡，如圖1中C所示。

圖1 原代雞胚心肌細胞形態(tài)學觀察圖（×400）

2.2 蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞活性的影響

圖2 不同濃度的蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞活性影響

如圖2 所示，隨著醇提物濃度增高，細胞活性總體呈上升趨勢，且都高于濃度為0 μg/ml。當濃度為50 μg/ml和5 μg/ml時，細胞活性分別達到了（124.21±5.94）%、（115.34±3.10）%，活性極顯著升高（P＜0.01）。

2.3 蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞抗熱應激活性的影響

如圖3 所示，隨著蟛蜞菊醇提物濃度的增高，熱應激組OD 值也隨之增大。熱應激組中濃度為5 和20 μg/ml 時，OD 值較濃度為0 μg/ml 的OD 值極顯著升高了17.98%和25.93%（P＜0.01）。熱應激組總體OD值均低于常溫組總體OD值，但隨著醇提物濃度的增高，熱應激組與常溫組兩者OD值差距逐漸減少，在濃度為5～20 μg/ml 時，兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 不同濃度的蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞抗熱應激活性影響

2.4 蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞上清液中AST和LDH酶含量檢測

如圖4所示，熱應激組AST和LDH酶含量在醇提物濃度為0 μg/ml時均達到最高值，隨著醇提物濃度的升高而降低，在濃度為5～20 μg/ml時極顯著下降至最低（P＜0.01）。熱應激組AST和LDH酶含量均高于常溫組。在濃度為0 μg/ml 時，熱應激組AST 和LDH 酶分別極顯著高于常溫組的29.00%與17.54%（P＜0.01），但隨著醇提物濃度的升高，兩者之間差距逐漸縮小，在濃度為5～20 μg/ml時，含量差距無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 不同濃度的蟛蜞菊醇提物對細胞上清液中AST（A）和LDH（B）濃度的含量影響

2.5 蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞的Hsp70蛋白表達的影響

如圖5 所示，熱應激空白組心肌細胞的Hsp70 表達量是常溫空白組的1.92 倍，表達量極顯著增加（P＜0.01）。熱應激組中，隨著醇提物濃度的升高，Hsp70表達量也隨之升高。相比較于濃度為0 μg/ml 時，濃度為20 μg/ml 的Hsp70 表達量分別極顯著升高了33.14%（P＜0.01）。

3 討論

3.1 熱應激對文昌雞胚原代心肌細胞活性的影響

高溫、高密度飼養(yǎng)環(huán)境下的畜禽常發(fā)生熱應激反應[14]。急性熱應激對機體心肌組織影響最為明顯，不僅會破壞心肌細胞之間的緊密連接，還會損害細胞結構和功能[15]。本研究圖1 中的B 和C 對比說明，在熱應激處理后心肌細胞的形態(tài)上出現(xiàn)了明顯皺縮和空泡現(xiàn)象，與Wu 等[16]、Xu等[17]研究結果一致。圖3結果表明，熱應激組OD 值均低于常溫組說明熱應激降低心肌細胞活性。

圖5 不同濃度的蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞的Hsp70 蛋白表達的影響

3.2 蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞抗熱應激保護作用

蟛蜞菊作為重要的南藥資源，因其資源含量豐富，廉價易得，且富含萜類、黃酮類、生物堿和揮發(fā)油類等多種活性物質，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化和抗病毒的作用效果[18-21]。Huang 等[19]研究表明蟛蜞菊水提物可以有效緩解小鼠右旋糖酐硫酸鈉誘導的結腸炎。Tsai等[20]研究表明，蟛蜞菊提取物通過阻礙AR信號通路抑制前列腺癌的生長。劉漫宇等[21]研究表明，蟛蜞菊醇提物通過p38蛋白使CNE-1細胞發(fā)生G2/M期阻滯，從而抑制CNE-1細胞的增殖。本研究中圖2結果表明，隨著蟛蜞菊醇提物濃度升高，心肌細胞活性也隨之升高，這說明適量的蟛蜞菊醇提物可以有效提高心肌細胞活性。圖3 結果顯示熱應激下的細胞活性表現(xiàn)出對醇提物濃度依賴性，在濃度為20 μg/ml達到最高值，說明蟛蜞菊醇提物對熱應激處理下的心肌細胞起保護作用，緩解熱應激對心肌細胞的損傷。

3.3 蟛蜞菊醇提物對熱應激處理下原代雞胚心肌細胞釋放AST和LDH酶的影響

AST和LDH廣泛存在于動物機體的心臟、肝臟和肌肉等器官組織中，是反應心肌細胞損傷程度的重要指標[5]。當正常細胞在受到某種應激情況下，細胞膜的通透性會增加，導致細胞質中的AST 和LDH 酶釋放[6]。秦士貞[22]研究發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下心肌細胞上清液中的LDH 和AST 酶活性會隨著高溫處理時間的增長而增強。本研究表明原代心肌細胞在熱應激作用下，上清液中的AST和LDH酶含量對比于常溫組顯著增高，說明熱應激對心肌細胞造成了明顯的損傷。但是隨著加入蟛蜞菊醇提物濃度升高，上清液中的AST 和LDH 酶含量在逐漸減少，并均在醇提物濃度為20 μg/ml 時降低到最低值，接近常溫組含量。結果表明，經適當濃度蟛蜞菊醇提物處理的原代心肌細胞可以在一定程度上緩解熱應激所帶來的損傷。

3.4 蟛蜞菊醇提物對熱應激處理下原代雞胚心肌細胞表達Hsp70的影響

Hsp70是熱休克蛋白重要且高度保守的成員，其分子質量大約為70 KD[23]，具有調控細胞凋亡、提升機體免疫、增強細胞抗氧化性和分子伴侶等生物功能[24]。研究報道顯示，在熱應激條件下Hsp70 通過過量表達修復機體因應激所產生的損傷并緩解后期應激的影響[25]。本研究結果表明常溫組的心肌細胞內的Hsp70 表達量比較低，熱應激處理后細胞的Hsp70表達量極顯著上升，也驗證了上述觀點。Tang等[26]研究人員發(fā)現(xiàn)，純化的迷迭香提取物可以有效地提高在熱應激下肉雞的Hsp70和晶狀體蛋白αB（CRYAB）的表達，緩解肉雞受熱應激的影響。Xu 等[27]研究表明，輔酶Q10通過增加熱休克因子1（HSF1）的表達，加速HSF1與熱休克元件（HSE）的結合，增加Hsp70的表達保護熱應激下的雞原代心肌細胞。本試驗結果顯示，熱應激條件下心肌細胞的Hsp70 表達量表現(xiàn)出濃度依賴性，并在濃度為20 μg/ml 達到最高。結果表明Hsp70 在原代心肌細胞抗熱應激效應中起到重要作用，蟛蜞菊醇提物有效緩解心肌細胞抗熱應激損傷可能與提升細胞Hsp70的表達量其密切相關。

4 結論

綜上所述，適當濃度的蟛蜞菊醇提物對原代雞胚心肌細胞無毒性，并具有提升細胞活性作用。同時，蟛蜞菊醇提物可以有效緩解熱應激下原代雞胚心肌細胞的損傷，在醇提物濃度為20 μg/ml時效果最好并顯著提高了心肌細胞Hsp70的表達。