張艷楠 王印庚 劉福利 廖梅杰 李 彬 張 正 梁洲瑞 于永翔 榮小軍

養(yǎng)殖長(zhǎng)莖葡萄蕨藻黑褐病的病原學(xué)研究*

張艷楠1,2王印庚2劉福利2廖梅杰2李 彬2張 正2梁洲瑞2于永翔2榮小軍2①

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

本研究從大連某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生黑褐病的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻()分離得到1株優(yōu)勢(shì)菌株CL2017070801002。采用該菌株濃度為103~108CFU/ml的菌液浸泡感染長(zhǎng)莖葡萄蕨藻，在7 d內(nèi)，每個(gè)感染實(shí)驗(yàn)組的藻體都出現(xiàn)了不同程度的黑褐色典型發(fā)病癥狀，人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CL2017070801002對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻有致病性。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，藻體細(xì)胞壁表面聚集大量細(xì)菌，隨著侵染時(shí)間加長(zhǎng)，細(xì)胞組織破裂死亡。研究表明，CL2017070801002為本次發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻黑褐病的病原。結(jié)合革蘭氏染色、生理生化特征和16S rDNA序列進(jìn)化樹分析結(jié)果，將該菌株鑒定為溶藻弧菌()。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對(duì)氯霉素、四環(huán)素、氟羅沙星、強(qiáng)力霉素和氟苯尼考等藥物高度敏感，對(duì)慶大霉素、克拉霉素等藥物中度敏感，對(duì)青霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定等藥物不敏感。本研究為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的細(xì)菌性病害防治提供了有益參考。

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻；黑褐病；溶藻弧菌

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻()，又名凸鏡狀蕨藻，屬于綠藻門(Chlorophyta)、羽藻綱(Bryopsodophyceae)、羽藻目(Bryoposodales)、蕨藻科(Caulerpaceae)、蕨藻屬()。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的外觀為渾圓飽滿的綠色球狀小枝，猶如串串葡萄，俗稱“海葡萄”(郭輝, 2014)。長(zhǎng)莖葡萄蕨藻主要分布于太平洋的熱帶和亞熱帶(30°N~30°S)的潮間帶海區(qū)，多生長(zhǎng)在水流較緩的沙地或礁石區(qū)域(Titlyanov, 2012)。

長(zhǎng)莖葡萄蕨藻具有極高的營(yíng)養(yǎng)與保健價(jià)值：富含人體所需的多種氨基酸與維生素(Saito, 2010)，蛋白質(zhì)含量為10.41%，總脂肪含量為1.6%~3.7% (Matanjun, 2009)，還含有ω-6多不飽和脂肪酸(Niwano, 2009)，其食用口感類似鮭魚卵，卻沒有魚腥味，被譽(yù)為“綠色魚子醬”。目前，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的市場(chǎng)售價(jià)約為200~250元/kg，養(yǎng)殖及相關(guān)產(chǎn)品的加工利用利潤(rùn)較高(張穎等, 2016)。在日本、越南和菲律賓等國家，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的養(yǎng)殖技術(shù)較為成熟(梁洲瑞等, 2016)。近年來，我國的福建、海南、遼寧和山東等地開啟了該藻的養(yǎng)殖熱潮。海南地區(qū)可整年進(jìn)行長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的養(yǎng)殖，福建沿海每年的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖周期一般為9~10個(gè)月，而遼寧和山東等北方海區(qū)一般可在5~9月時(shí)開展長(zhǎng)莖葡萄蕨藻室內(nèi)養(yǎng)殖，養(yǎng)殖周期較短。雖然北方海區(qū)養(yǎng)殖周期短，但可以利用高溫期時(shí)閑置的養(yǎng)殖車間，從而提高車間使用率。如海參行業(yè)下滑，大連沿海有大量閑置的海參育苗車間，對(duì)這些閑置車間進(jìn)行屋頂改造(改為可透光的)，開展長(zhǎng)莖葡萄蕨藻等名貴藻類的室內(nèi)養(yǎng)殖是一個(gè)可提高漁民收入的有效途徑。隨著我國長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，病害問題日益突出，成為制約其健康可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一，如大連地區(qū)近2年進(jìn)行的小規(guī)模長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖過程均受困于病害問題，產(chǎn)量及質(zhì)量均受到嚴(yán)重的影響，導(dǎo)致該地區(qū)的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)停滯不前。

目前，國內(nèi)外大部分學(xué)者對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的研究集中在其生物學(xué)特性和人工養(yǎng)殖技術(shù)方面，例如，在解析適宜的水溫、光強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)鹽濃度及鹽度等環(huán)境因子對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻生長(zhǎng)的影響，確定長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖的適宜密度，比較不同類型附著基的養(yǎng)殖效果等方面取得了一定的進(jìn)展(黃建輝, 2012)。然而，有關(guān)該藻的病害防治技術(shù)鮮有報(bào)道，僅Kudaka等(2008)關(guān)于副溶血弧菌()引起長(zhǎng)莖葡萄蕨藻腐敗變質(zhì)的病例分析，并提出了可以在藻類培養(yǎng)過程中通過紫外殺菌來預(yù)防該病的方法。

我國是海藻養(yǎng)殖第一大國，但在藻類病害的研究方面相對(duì)薄弱，關(guān)于藻類病原菌的微觀形態(tài)描述和致病機(jī)理研究較少。

本文對(duì)大連某養(yǎng)殖場(chǎng)2017年7月暴發(fā)的一種長(zhǎng)莖葡萄蕨藻病害(病癥為藻體表面由翠綠色變成黑褐色)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。從發(fā)病率高達(dá)30%的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻發(fā)病藻體黑褐色病灶部位分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，采用柯赫氏法則(Evans, 1976)對(duì)該菌進(jìn)行了鑒定，并通過回接感染實(shí)驗(yàn)確定該菌為病原菌。同時(shí)，對(duì)處于不同感染階段的病藻藻體進(jìn)行了掃描電鏡觀察，解析在病原感染藻體過程中的微觀病理特征。本研究結(jié)果為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的健康養(yǎng)殖以及細(xì)菌性病害防控提供了有益參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 患病長(zhǎng)莖葡萄蕨藻 患病長(zhǎng)莖葡萄蕨藻于2017年7月，采自大連某海藻養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖場(chǎng)水溫為26℃~27℃，常溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在24 h內(nèi)進(jìn)行分析。

1.1.2 健康長(zhǎng)莖葡萄蕨藻 健康長(zhǎng)莖葡萄蕨藻采自大連室內(nèi)養(yǎng)殖水池，在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，鹽度為30，光照為3000~5000 lx，光暗周期為L(zhǎng)∶D=12∶12，充氣培養(yǎng)，每隔3 d更換1次過濾海水，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 長(zhǎng)莖葡萄蕨藻培養(yǎng)液成分 NO3-N濃度為15 mg/kg，PO4-P濃度為4 mg/kg。

1.1.4 試劑及固定液配方 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌TSA平板、TCBS瓊脂平板和細(xì)菌生化反應(yīng)微量鑒定管購自青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。電鏡固定液為2.5%戊二醛(體積比為25%的戊二醛溶液∶20′PBS緩沖液∶ddH2O=1∶5∶4)。

1.1.5 儀器設(shè)備 YXQ-LS-SII電熱壓力蒸汽滅菌鍋，SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，Centrifuge 5804R低溫冷凍離心機(jī)，NanoDrop 1000紫外分光光度計(jì)，Nikon E800光學(xué)顯微鏡，JEM-1200EX型透射電子顯微鏡，VEGA3 TESCAN掃描電鏡。

1.2 病原菌的分離和純化

選取患病癥狀明顯的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻，現(xiàn)場(chǎng)剪切匍匐莖、直立枝組織，用無菌海水漂洗3次后，取患病藻體的典型病灶部位，并以健康藻體的組織為對(duì)照同步取樣，進(jìn)行常規(guī)水浸片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。同時(shí)，在無菌的條件下，用剪刀把病灶處藻體組織剪下，置于無菌的研缽中研磨勻漿，勻漿液用滅菌海水梯度稀釋，每個(gè)稀釋度吸取100 μl稀釋液分別涂布于TSA平板和TCBS瓊脂平板，在28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~36 h。觀察菌落生長(zhǎng)和形態(tài)，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落在新鮮培養(yǎng)基上重復(fù)劃線純化3次以上，直至分離到單菌落，分離純化后的菌株置于-80℃保存。

1.3 人工回接感染實(shí)驗(yàn)

將從患病長(zhǎng)莖葡萄蕨藻病灶處分離得到的優(yōu)勢(shì)菌用于人工回接感染實(shí)驗(yàn)。刮取培養(yǎng)皿中分離純化的優(yōu)勢(shì)菌置于500 ml TSB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液6000 r/min離心10 min，收集菌體。用滅菌海水洗滌細(xì)菌，將菌株用滅菌海水配制成終濃度為108CFU/ml的菌懸液(采用酶標(biāo)儀和平板計(jì)數(shù)法結(jié)合計(jì)算)，10倍濃度梯度稀釋后備用。設(shè)6個(gè)濃度組A1~ A6，對(duì)應(yīng)濃度分別為103、104、105、106、107和108CFU/ml，每個(gè)濃度各設(shè)3個(gè)平行組。采用浸浴的方式進(jìn)行回接感染：500 ml菌懸液分裝至1000 ml錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中放入1.5 g藻體。設(shè)置不加菌液的滅菌海水培養(yǎng)液為對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)(B1、B2和B3)。放置于光照培養(yǎng)箱中養(yǎng)殖(溫度為28℃，光強(qiáng)為3000~5000 lx，光周期為12 h/12 h；培養(yǎng)液中NO3-N濃度為15 mg/kg，PO4-P濃度為4 mg/kg。實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，每2 d更換1次菌懸液。每天觀察并記錄藻體健康情況，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組藻體出現(xiàn)黑褐色典型發(fā)病特征時(shí)，切取病灶部位進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定。

1.4 掃描電子顯微鏡切片的制備與觀察

選取藻體出現(xiàn)顏色變化的感染部位，剪取大小約為1 mm3的組織塊，放入含2.5%戊二醛的電鏡固定液中固定，用于掃描電子顯微鏡觀察。

將用2.5%戊二醛的電鏡固定液固定的組織塊在4℃條件下固定24 h后，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min；1%的鋨酸固定1.5 h；磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min；將固定好的材料用梯度濃度的乙醇脫水，再用醋酸戊酯作為中間介質(zhì)，置換脫水劑，然后在臨界點(diǎn)干燥器中用固體CO2等置換劑置換中間介質(zhì)，進(jìn)行臨界干燥；將干燥的樣品用導(dǎo)電性好的粘合劑或其他粘合劑粘在金屬樣品臺(tái)上，然后放在真空蒸發(fā)器中噴鍍一層50~300 ?厚的金屬膜，樣品用掃描電鏡觀察、拍照。

1.5 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察與生理生化特性測(cè)定

將分離菌株在TSA和TCBS瓊脂平板上接種劃線，觀察菌落形態(tài)、大小。挑取單一菌落，采用革蘭氏染色液試劑盒對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。同時(shí)挑取新鮮菌落，2.5%戊二醛固定，pH7.0的2%磷鎢酸負(fù)染色液染色，進(jìn)行透射電鏡觀察。并在無菌條件下挑取單一菌落，制備菌懸液，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第九版)和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(Holt, 1994; 東秀珠等, 2001)，用生化鑒定管測(cè)定細(xì)菌生理生化指標(biāo)。

1.6 細(xì)菌16S rDNA序列測(cè)定

1.6.1 PCR模板DNA的制備 用滅菌槍頭挑取單菌落懸浮于50 μl無菌去離子水中，100℃水浴10 min，12000 r/min離心2 min，取1 μl上清液作為PCR反應(yīng)所用模板DNA(范文輝等, 2005)。

1.6.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 利用擴(kuò)增16S rDNA序列通用引物，正向引物27F：5￠-AGAGTTTGATCCTGG-CCTGGCTCAG-3￠，反向引物1492R：5￠-TACGGCTA-CCTTGTTACGACTT-3￠。PCR反應(yīng)體系見表1(許燕, 2017)。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃復(fù)性40 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸20 min，4℃保存。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在GenBank中使用BLAST (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行同源性比較，在網(wǎng)站(http:// www.bacterio.net/vibrio.html)搜集下載與該菌株同屬且相似度較高的其他菌株序列信息，采用MEGA 6軟件進(jìn)行序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

表1 PCR反應(yīng)體系(許燕, 2017)

Tab.1 Reaction system of PCR amplification(Xu, 2017)

1.7 藥敏實(shí)驗(yàn)

將菌株在TSB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24 h后，用1.5%無菌生理鹽水沖洗稀釋，制成108CFU/ml的菌懸液，取100 μl均勻涂布于TSA固體培養(yǎng)基平板，將藥敏紙片貼于該培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上貼5片，28℃培養(yǎng)16 h后，測(cè)定抑菌圈直徑，記錄其大小，根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)標(biāo)準(zhǔn)，判定細(xì)菌對(duì)該抗生素是高度敏感(Susceptible, S)、耐藥(Resistant, R)、中度敏感(Intermediate, I) (苗鵬飛等, 2018)。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病藻體臨床癥狀

患病長(zhǎng)莖葡萄蕨藻病灶部位整體呈黑褐色，觸感軟、粘，嚴(yán)重感染的匍匐莖呈明顯的深黑褐色，頂端藻體出現(xiàn)潰爛(圖1A)；在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，患病的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻表面黏附很多簇蟲、線蟲，且有許多雜藻附著在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻藻體上(圖1B)；正常藻體透明翠綠、表面光滑(圖1C, 圖1D)。

2.2 病原菌株培養(yǎng)形態(tài)

從患病藻體的病灶組織分離到1種優(yōu)勢(shì)菌，在TSA和TCBS瓊脂平板上培養(yǎng)18~24 h，觀察TCBS瓊脂平板，形成規(guī)則圓形、中間隆起、表面光滑且呈黃色的菌落(圖2A)。在TSB培養(yǎng)液上培養(yǎng)16 h后，菌液呈渾濁的淡黃色。經(jīng)革蘭氏染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌被染為紅色，兩端鈍圓、菌體直或少彎曲、短桿狀(圖2B)，確定為革蘭氏陰性菌。透射電鏡下可見該菌有一根細(xì)長(zhǎng)的端生鞭毛，無莢膜，無芽孢(圖2C)。將分離到的菌株編號(hào)為CL2017070801002。

圖1 患病的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻

A：感染黑褐病的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻外觀；B：簇蟲、線蟲和雜藻附著在病爛長(zhǎng)莖葡萄蕨藻表面；C和D：對(duì)照組顏色翠綠，病爛組出現(xiàn)黑褐色病變(體式顯微鏡)

A: Syndrome ofinfected black-brown disease; B: Gregarina, Nematode and miscellaneous algae attached to the surface of diseased; C and D: The color of the control group was green, and the infected group showed dark brown lesions (stereo microscope)

圖2 患病長(zhǎng)莖葡萄蕨藻分離出的優(yōu)勢(shì)菌CL2017070801002的形態(tài)

A：TCBS瓊脂平板上的菌落；B：革蘭氏染色；C：透射電鏡圖

A: Colony on TCBS medium; B: Gram stain; C: Transmission electron microscope figure

2.3 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用不同濃度的CL2017070801002菌懸液感染健康的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻，除對(duì)照組外，每個(gè)感染實(shí)驗(yàn)組都出現(xiàn)不同程度的感染癥狀，其中，108CFU/ml組2 d出現(xiàn)黑褐色典型癥狀，≤105CFU/ml的實(shí)驗(yàn)組7 d后出現(xiàn)感染。另外，感染用的菌液濃度越高，患病藻體的感染面積越大(圖3)。

以濃度為108CFU/ml的CL2017070801002菌懸液感染長(zhǎng)莖葡萄蕨藻，感染后的第2~3天，可肉眼觀察到藻體頂端呈黃色；從第4天開始，養(yǎng)殖水體濁度明顯增加，藻體顏色加深，由黃色逐漸變?yōu)榧t褐色，最后，整個(gè)藻體病變直至潰爛。實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組沒有出現(xiàn)病變，感染組出現(xiàn)明顯的紅褐色病變。從患病藻體分離得到的菌株編號(hào)為CL2017070801002A。CL2017070801002A的菌落形態(tài)與CL2017070801002相同，通過16S rRNA分析，與CL2017070801002為同一種細(xì)菌。

2.4 感染藻體掃描電鏡觀察

圖4所示，對(duì)照組的直立枝球狀體部分形態(tài)正常，表面光滑且無其他生物附著，結(jié)構(gòu)完整(圖4A)；感染組在接種菌株CL2017070801002的前期，創(chuàng)傷處明顯可見少量絲狀物粘附，且附著少量細(xì)菌(圖4B)；感染后期，患病藻體的直立枝球狀體表面有大量細(xì)菌，表面形態(tài)變得極不規(guī)則，組織結(jié)構(gòu)被破壞(圖4C)；患病藻體中粘附大量絲狀物，充斥整個(gè)藻體(圖4D)；同時(shí)，在患病藻體表面還發(fā)現(xiàn)許多異物附著(圖4E)；藻體感染后直至潰爛的過程中，均有大量的絲狀物等附著(圖4F)。

圖3 感染菌株CL2017070801002后的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻發(fā)病癥狀(感染第7天后)

A. 103CFU/ml; B: 104CFU/ml; C: 105CFU/ml; D: 106CFU/ml; E: 107CFU/ml; F: 108CFU/ml

圖4 病爛長(zhǎng)莖葡萄蕨藻掃描電子顯微鏡觀察

A：健康的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻；B：接種病原菌后，感染前期，少量的細(xì)菌附著在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻創(chuàng)傷口處；C：感染后期，患病藻體表面聚集大量菌，組織結(jié)構(gòu)被破壞；D：絲狀物附著在病爛長(zhǎng)莖葡萄蕨藻表面；E：未知物附著在病爛長(zhǎng)莖葡萄蕨藻表面；F：感染后潰爛的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻(包含眾多絲狀物和未知物)

A: Healthy; B: After inoculation, early infection, a small amount of bacteria attached to thewound; C: Late infection, a large number of bacteria got around, and the tissue structure is destroyed; D: Filaments attached to the surface of diseased;E: Unknown attached to the surface of diseased; F: Late infection, fester(Contains many filaments and unknowns)

2.5 病原菌生理生化特性

對(duì)分離菌株CL2017070801002進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡觀察顯示，菌株為革蘭氏陰性短桿菌。生理生化特征分析結(jié)果顯示：氧化酶反應(yīng)陽性，鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶反應(yīng)陽性，精氨酸雙水解酶和MR-VP反應(yīng)陰性，能利用蔗糖、甘露醇，不能利用乳糖、山梨醇、肌醇、鼠李糖等，其余特征見表2。

2.6 16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增病原菌CL2017070801002的16S rDNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)表明片段大小為1400 bp左右，將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與溶藻弧菌()的同源性最高，相似度為99%，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載與該菌株序列相似度較高的16S rDNA基因序列，利用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，結(jié)果顯示，該菌與溶藻弧菌聚為一簇，確認(rèn)菌株CL2017070801002為溶藻弧菌。

2.7 藥敏實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)的36種藥物中，該菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素、氟羅沙星、強(qiáng)力霉素和氟苯尼考等藥物高度敏感，對(duì)慶大霉素、克拉霉素等藥物中度敏感，對(duì)青霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定等藥物不敏感(表3)。

表2 病原菌CL2017070801002和CL2017070801002A形態(tài)特性及生理生化特征

Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain CL2017070801002 and CL2017070801002A

注：“-”：陰性；“+”：陽性

Note: ‘-’: Negative; ‘+’: Positive

圖5 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的菌株CL2017070801002的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 菌株CL2017070801002對(duì)抗菌藥物的敏感性

Tab.3 Sensitivity of the strain CL2017070801002 to antibacterial drugs

注：“R”：耐藥；“M”：中度敏感；“S”：高度敏感

Note: ‘R’: Resistance; ‘M’: Intermediate; ‘S’: Sensitivity

3 討論

本研究從患黑褐病長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中分離得到 1株優(yōu)勢(shì)菌CL2017070801002，在TCBS瓊脂平板上為黃色，邊緣透明，中間隆起，有黏性，革蘭氏染色為陰性；經(jīng)電鏡負(fù)染，觀察到菌株呈短桿狀，端生單鞭毛；氧化酶反應(yīng)陽性。經(jīng)人工回接感染，藻體出現(xiàn)與自然患病相同的癥狀，證實(shí)該菌對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻具有較強(qiáng)的致病力。綜合生理生化特征分析，16S rDNA基因序列比對(duì)分析等方法將該菌株鑒定為溶藻弧菌。

由弧菌引起的海洋生物疾病，流行面積廣，發(fā)病率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大危害，長(zhǎng)期以來是水產(chǎn)領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)(楊少麗等, 2005)。溶藻弧菌具有較強(qiáng)的致病力，林業(yè)杰等(1998)報(bào)道了溶藻弧菌含有多種致病因子，近年來，在養(yǎng)殖大黃魚()、大菱鲆()等魚類和羅氏沼蝦()中發(fā)現(xiàn)有溶藻弧菌感染的病例(金珊等, 2003; 姜燕等, 2016; 苗鵬飛, 2018)，本研究首次報(bào)道了在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖過程中溶藻弧菌作為潛在的致病菌感染藻體的案例，溶藻弧菌感染范圍正不斷擴(kuò)大，應(yīng)當(dāng)引起重視。細(xì)菌粘附于宿主細(xì)胞表面是機(jī)體感染致病的先決條件(戴卓捷等, 2001)。利用掃描電鏡觀察溶藻弧菌對(duì)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的侵染過程，發(fā)現(xiàn)感染初期，藻體的細(xì)胞壁表面出現(xiàn)少量的細(xì)菌；隨著感染加重，藻體細(xì)胞壁表面聚集大量細(xì)菌，細(xì)胞壁逐漸被破壞，同時(shí)給線蟲、簇蟲和雜藻等附著物提供有利環(huán)境，使其快速生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致藻體細(xì)胞組織逐漸破裂，直至死亡。

細(xì)胞壁是抵抗病原菌入侵的第一道屏障，在養(yǎng)殖環(huán)境中，線蟲、簇蟲和雜藻等附著物對(duì)藻體造成的機(jī)械損傷可能是該菌株侵染的先決條件。韓寶芹等(1997)報(bào)道海帶配子體的細(xì)胞壁中含有大量的褐藻膠及各種多糖類物質(zhì)，褐藻酸降解菌會(huì)產(chǎn)生褐藻酸酶，可以分解利用作為細(xì)胞壁填充物質(zhì)的褐藻膠，使細(xì)胞間質(zhì)變得松弛，并導(dǎo)致藻體軟化。彭艷婷(2012)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌首先侵染海帶配子體細(xì)胞的細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞壁后侵入原生質(zhì)體，并利用其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，當(dāng)配子體細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以維持其生長(zhǎng)繁殖時(shí)，便從細(xì)胞壁中涌出，尋找新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，最后導(dǎo)致配子體細(xì)胞的破碎、死亡。

Zanetti等(2000)研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌可粘附在上皮細(xì)胞(Hep-2和Caco-2)上。Baffone等(2001)研究了20株溶藻弧菌對(duì)Hep-2細(xì)胞的粘附情況，其中，有11株菌對(duì)其有較強(qiáng)的粘附作用。大多數(shù)革蘭氏陰性菌在宿主細(xì)胞上的粘附受體是糖蛋白或糖脂，其受體特異性部位往往是其中的糖類殘基(陳強(qiáng)等, 2006)，而長(zhǎng)莖葡萄蕨藻中多糖含量較為豐富(姜芳燕等,2014)，與其容易受到溶藻弧菌的感染密切相關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)，藻體受到創(chuàng)傷后，創(chuàng)傷部位先出現(xiàn)大量病原菌粘附和繁殖，進(jìn)而造成藻體組織嚴(yán)重?fù)p害，最終導(dǎo)致整個(gè)藻體死亡潰爛。由此推斷，藻體細(xì)胞壁的多糖含量較為豐富，容易遭受細(xì)菌粘附，隨著感染時(shí)間的加長(zhǎng)，細(xì)菌首先侵染藻體細(xì)胞壁，抵抗病原菌入侵的第一道屏障被破壞，細(xì)菌會(huì)繼續(xù)尋找藻體中新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，最后導(dǎo)致藻體細(xì)胞的破碎、死亡。

綜上所述，對(duì)于溶藻弧菌引起的長(zhǎng)莖葡萄蕨藻黑褐病防控要重點(diǎn)從控制養(yǎng)殖系統(tǒng)中的病原菌數(shù)量入手。在實(shí)驗(yàn)室條件下，105CFU/ml濃度溶藻弧菌感染長(zhǎng)莖葡萄蕨藻，第10天即可導(dǎo)致出現(xiàn)明顯病變，濃度越高，發(fā)病時(shí)間越短，發(fā)病程度越大。因此，可在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖生產(chǎn)中監(jiān)控溶藻弧菌等病原的數(shù)量在104CFU/ml以下，如果監(jiān)測(cè)到其病原的數(shù)量在104CFU/ml以上，可采取紫外處理水體、使用一些安全的消毒劑等手段(劉志軒等, 2006)及時(shí)預(yù)防黑褐病的發(fā)生。對(duì)于藻體病害，正確選擇和使用消毒劑尚待深入研究，以期得到最佳消毒效果。

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Etiology of Black-Brown Disease in Cultured

ZHANG Yannan1,2, WANG Yingeng2, LIU Fuli2, LIAO Meijie2, LI Bin2, ZHANG Zheng2, LIANG Zhourui2, YU Yongxiang2, RONG Xiaojun2①

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Pilot National Laboratory for Marine Sciences and Technology (Qingdao), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071)

is a seaweed species with increasing large-scale economic value due to its nutritional and health benefits. With the expansion of farming scale, problems associated with various diseases are becoming more common and severe. However, few research focusing on this topic have been published. In this study, the strain CL2017070801002 was isolated from, which was diagnosed with black-brown disease in Dalian′s breeding farm. Following infection of healthywith this strain at a concentration of 103~108CFU/ml, each experimental group developed different black-brownlesions within 7 days. Under scanning electron microscopy, a large number of bacteria were accumulated on the cell surface of the alga, and the cells ruptured and died over time. These results indicated that CL201707070801002 was the causative pathogen of black-brown disease of. Using gram staining as well as physiological and biochemical characteristics based on a 16S rDNA phylogenetic tree, the strain was identified as. CL2017070801002 was highly sensitive to chloramphenicol, tetracycline, fleroxacin, doxycycline, and florfenicol; moderately sensitive to gentamicin and clarithromycin; and not sensitive to penicillin and cephalosporin. These results will provide useful information for the prevention and control of bacterial diseases of.

; Black-brown disease;

S946.3

A

2095-9869(2020)01-0135-10

10.19663/j.issn2095-9869.20181104002

* 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-50)資助[This work was supported by China Agriculture Research System (CARS-50)]. 張艷楠，E-mail: 1519056881@qq.com

榮小軍，研究員，E-mail: rongxj@ysfri.ac.cn

2018-11-04,

2018-12-10

http://www.yykxjz.cn/

張艷楠, 王印庚, 劉福利, 廖梅杰, 李彬, 張正, 梁洲瑞, 于永翔, 榮小軍. 養(yǎng)殖長(zhǎng)莖葡萄蕨藻黑褐病的病原學(xué)研究. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(1): 135–144

Zhang YN, Wang YG, Liu FL, Liao MJ, Li B, Zhang Z, Liang ZR, Yu YX, Rong XJ. Etiology of black-brown disease in cultured. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(1): 135–144

RONG Xiaojun, E-mail: rongxj@ysfri.ac.cn

(編輯 馬璀艷)