楊 凱 黃智慧 馬愛(ài)軍 劉曉菲 楊雙雙

高溫脅迫條件下大菱鲆腎臟轉(zhuǎn)錄組研究*

楊 凱1,2,3黃智慧1,3馬愛(ài)軍1,3①劉曉菲1,3楊雙雙1,3

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省海洋漁業(yè)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島市海水魚(yú)類(lèi)種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

為探索大菱鲆()耐高溫的分子機(jī)制，篩選耐高溫相關(guān)基因，采用高通量測(cè)序平臺(tái)(IlluminaHiSeq-2500)分別對(duì)5個(gè)不同高溫處理組的大菱鲆腎臟組織開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括GO(基因功能注釋)、SSR(簡(jiǎn)單重復(fù)序列)分析等。結(jié)果顯示，通過(guò)組裝得到Unigenes總數(shù)目為68525，長(zhǎng)度范圍為201~23456 bp，平均長(zhǎng)度為1124 bp，N50長(zhǎng)度為2316 bp。將Unigenes分別在Nr、Swissprot、KEGG、KOG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)及功能注釋?zhuān)沧⑨?5498條，其中，Nr數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的Unigenes最多；按GO功能分類(lèi)，共分為細(xì)胞組分、分子功能及生物學(xué)過(guò)程3類(lèi)，包括56個(gè)功能組，其中，大量Unigenes與細(xì)胞進(jìn)程、代謝過(guò)程、催化活性、生物調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。將Unigenes進(jìn)行pathway注釋?zhuān)瑲w屬于218條代謝通路，分為5類(lèi)KEGG途徑：代謝途徑、遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息和生物系統(tǒng)。進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析，共檢測(cè)到65類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，其中，C2H2鋅指蛋白家族的基因數(shù)目最多。通過(guò)對(duì)不同溫度脅迫下基因表達(dá)譜結(jié)果進(jìn)行分析，不同溫度組之間存在著顯著差異，在不同溫度脅迫組中，20℃組與28℃組存在差異最大，差異基因達(dá)到4734個(gè)，其中，上調(diào)基因3386個(gè)，下調(diào)基因1348個(gè)。本研究建立了大菱鲆熱應(yīng)激腎臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，為大菱鲆高溫脅迫分子機(jī)理研究提供了參考數(shù)據(jù)。

大菱鲆；腎臟；高溫脅迫；轉(zhuǎn)錄組；生物信息學(xué)分析

大菱鲆()為我國(guó)北方沿海工廠化養(yǎng)殖業(yè)的主導(dǎo)品種之一(雷霽霖等, 2002)。大菱鲆為冷溫性魚(yú)類(lèi)，對(duì)溫度等環(huán)境指標(biāo)要求較嚴(yán)，適宜生長(zhǎng)水溫為12℃~19℃；通常在良好的充氣和流水條件下，耐受高溫可達(dá)25℃~26℃(馬愛(ài)軍等, 2012)，但對(duì)夏季高溫耐受能力較差。因受水溫條件限制，我國(guó)北方主要采用“養(yǎng)殖大棚+深井海水”模式進(jìn)行養(yǎng)殖，但近年來(lái)，隨著地下海水的匱乏，南北接力養(yǎng)殖模式的出現(xiàn)，養(yǎng)殖生產(chǎn)中對(duì)大菱鲆耐高溫新品種的需求日益增加(關(guān)健等, 2013)。另外，應(yīng)用分子生物學(xué)手段，加快開(kāi)展大菱鲆耐熱性狀的分子機(jī)制研究，對(duì)于培育耐高溫的養(yǎng)殖品種具有較大意義。

轉(zhuǎn)錄組是指生物體的細(xì)胞或組織在特定的狀態(tài)下基因組所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA，反映了基因在不同生命階段、生理狀態(tài)、組織類(lèi)型以及環(huán)境條件下表達(dá)的情況(羅輝等, 2015)。生物抗逆性受多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，需要多基因協(xié)同表達(dá)(崔文曉等, 2017)，因此，開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選關(guān)鍵信號(hào)通路及主效基因、轉(zhuǎn)錄因子等，并利用關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用促使多個(gè)功能基因表達(dá)來(lái)提高魚(yú)類(lèi)機(jī)體的抗逆性，是一種非常有效的方法和途徑。近年來(lái)，從轉(zhuǎn)錄水平分析生物對(duì)環(huán)境脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制的相關(guān)研究屢見(jiàn)不鮮。如在水生生物中，Bilyk等(2014)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，探索了博氏南冰鰧()應(yīng)對(duì)溫度脅迫的分子機(jī)制，并首次推測(cè)性別會(huì)影響?hù)~(yú)類(lèi)應(yīng)對(duì)溫度脅迫時(shí)基因的轉(zhuǎn)錄；Huang等(2018)在熱應(yīng)激條件下對(duì)虹鱒魚(yú)()頭腎進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜研究，但僅開(kāi)展了常溫組(18)、高溫組(24) 2個(gè)溫度點(diǎn)的比較分析。

本研究為了盡可能完整、系統(tǒng)地獲得熱應(yīng)激對(duì)大菱鲆腎臟影響的數(shù)據(jù)信息，通過(guò)增加溫度點(diǎn)，對(duì)頭腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，包括基因功能注釋、SSR(簡(jiǎn)單重復(fù)序列)分析等，探討差異基因的表達(dá)情況，為建立大菱鲆熱應(yīng)激條件下的物質(zhì)代謝途徑，構(gòu)建信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路模型，及發(fā)掘新的耐溫基因提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)及樣品采集

實(shí)驗(yàn)用大菱鲆養(yǎng)殖于山東省煙臺(tái)市開(kāi)發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司，均為人工繁育的健康幼魚(yú)。幼魚(yú)為隨機(jī)挑選，平均體重為(100±12.3) g，于實(shí)驗(yàn)室玻璃水缸(1 m直徑, 1 m深)暫養(yǎng)7 d。根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，共設(shè)計(jì)5個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度：(13±1)℃(常溫CT)、20℃(T1)、23℃(T2)、25℃(T3)和28℃(T4)。升溫方法參照Diegane等(2007)并優(yōu)化：從常溫(13±1)℃按每12 h增加1℃的速度升高至實(shí)驗(yàn)水溫，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)平行組，每組投放15尾大菱鲆幼魚(yú)。馴養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)期間，每日早晚各投喂1次自制人工餌料，并換水1次。采用靜水法，自動(dòng)恒溫加熱器控溫；到達(dá)實(shí)驗(yàn)溫度并維持12 h后，每個(gè)平行組取3尾魚(yú)體腎臟組織，即每個(gè)處理組共取9尾幼魚(yú)，將9個(gè)樣本放入1.5 ml EP管中用液氮速凍，置于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取

將對(duì)照組及處理組中的每個(gè)平行組的3個(gè)樣本混合均勻后，提取樣品總RNA，即每組處理3份生物學(xué)重復(fù)。提取方法：取腎臟組織在液氮中研磨成粉末，用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京)提取總RNA。用NanoDrop 2000核酸檢測(cè)儀(Thermo公司, 美國(guó))檢測(cè)RNA純度，用核酸分析儀Agilent2100 (安捷倫科技公司, 美國(guó))檢測(cè)總RNA濃度及RNA質(zhì)量。

1.3 腎臟轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

RNA-Seq文庫(kù)制備及測(cè)序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeqTM2500，采用雙末端測(cè)序方法。

1.4 序列拼接與功能注釋、富集

去除原始序列數(shù)據(jù)中含有接頭及低質(zhì)量的序列后，得到Clean reads，并進(jìn)行De novo組裝。使用短reads組裝軟件Trinity將轉(zhuǎn)錄組從頭組裝成Unigenes數(shù)據(jù)集。通過(guò)blastx將Unigenes序列比對(duì)到Nr、SwissProt、KEGG和COG，得到Unigenes的蛋白功能注釋信息。對(duì)所有Unigenes進(jìn)行GO功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)、KEGG Pathway注釋及通路富集分析。

1.5 預(yù)測(cè)編碼蛋白框和轉(zhuǎn)錄因子

按Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG/KOG的優(yōu)先級(jí)順序?qū)nigenes序列與以上蛋白庫(kù)做blastx比對(duì)(E值<1×10–5)，利用Hmmsearch將Unigenes的ORF比對(duì)到TF數(shù)據(jù)庫(kù)(Animal TFdb)預(yù)測(cè)TF，并將預(yù)測(cè)的TF按照家族類(lèi)型分類(lèi)。

1.6 微衛(wèi)星(SSR)分析

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeat, SSR)又稱(chēng)微衛(wèi)星DNA，利用MISA軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組的所有Unigenes進(jìn)行搜索，查找SSR。搜索標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)巍⒁?、二、三、四、五、六核苷酸基?Motif)至少重復(fù)次數(shù)分別為10、8、5、4、3、3，對(duì)查找的SSR類(lèi)型進(jìn)行特征分析(賈新平等, 2014)。

1.7 基因表達(dá)差異分析

Unigene表達(dá)量的計(jì)算使用RPKM法(Reads Per kb per Million reads)計(jì)算，RPKM法能消除基因長(zhǎng)度和測(cè)序量差異對(duì)計(jì)算基因表達(dá)的影響，計(jì)算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品間的基因表達(dá)差異。分組之間的差異基因統(tǒng)計(jì)，利用FDR與log2FC篩選，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1，其中，F(xiàn)C (Fold Change, FC)標(biāo)示兩樣品間表達(dá)量的比值。得到差異表達(dá)基因之后，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，KEGG Pathway注釋及通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝

利用Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大菱鲆不同溫度脅迫條件下腎臟組織開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，1個(gè)對(duì)照組與4個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度組共獲得Raw reads及去除雜質(zhì)后的Clean reads (表1)。由表1可以看出，共得到224,473,610個(gè)Clean reads片段，包含了99.7 Gb的序列信息，GC%含量平均值為51.05%。在測(cè)序質(zhì)量值統(tǒng)計(jì)評(píng)估方面，堿基Q30為88.65%，由以上數(shù)據(jù)得出，該轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)量和質(zhì)量都較高，可為后續(xù)的組裝提供可靠的原始數(shù)據(jù)。

采用Trintiy軟件對(duì)Clean reads組裝，共獲得Unigenes總數(shù)目為68525，長(zhǎng)度范圍為201~23456 bp，平均長(zhǎng)度1124 bp，N50長(zhǎng)度2316 bp。組裝數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。Unigenes長(zhǎng)度分布圖見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示，組裝完整性較高，從而為后續(xù)信息學(xué)注釋及差異基因的篩選奠定了基礎(chǔ)。

表1 大菱鲆高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

Tab.1 Statistics of transcriptome sequencing data of heat stress of turbot

表2 大菱鲆高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組組裝數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

Tab.2 Statistics of transcriptome assembly data of heat stress of turbot

圖1 Unigene長(zhǎng)度分布

2.2 大菱鲆腎臟轉(zhuǎn)錄組Unigenes的功能注釋、分類(lèi)和代謝途徑分析

2.2.1 Unigenes的注釋及序列相似性分析 將Unigenes分別在Nr、Swissprot、KEGG、KOG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)及功能注釋?zhuān)沧⑨?5498條Unigenes。其中，Nr數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到的Unigenes數(shù)量最多，具體結(jié)果分別為：Nr庫(kù)25442條，Swissprot庫(kù)21179條，KEGG庫(kù)15488條，KOG庫(kù)17111條，Go庫(kù)12760條(表3)。

表3 Unigene的注釋結(jié)果

Tab.3 The result of Unigene′s annotation

利用Blastx將組裝出來(lái)的Unigene序列與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，功能注釋匹配的物種中，大黃魚(yú)()所占的比例最高(29.2%)，隨后依次是雀鯛() (23.1%)、羅非魚(yú)() (5.3%)、革首南極魚(yú)() (4.7%)、半滑舌鰨() (4.7%)等物種。

2.2.2 Unigenes的GO分類(lèi) 采用Blast2Go軟件，結(jié)合GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)大菱鲆的Unigene進(jìn)行功能分類(lèi)，從宏觀上分析大菱鲆熱應(yīng)激脅迫后表達(dá)基因的功能分布特征。在Go分類(lèi)體系中，共有3個(gè)Ontology，分別描述基因的生物學(xué)過(guò)程(Biological process)、細(xì)胞組分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)。結(jié)果表明，共有12760條Unigenes獲得GO注釋?zhuān)瑒澐譃?6個(gè)功能組，并對(duì)每個(gè)功能組涉及的Unigene進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖2)。注釋到Molecular function上的基因數(shù)目最多，為10053個(gè)，其次是Biological process 9644個(gè)，Cellular component 6270個(gè)。其中，細(xì)胞進(jìn)程6041個(gè)，單生物代謝過(guò)程5240個(gè)，代謝過(guò)程4842個(gè)，催化活性4681個(gè)，細(xì)胞3874個(gè)，生物調(diào)節(jié)3535個(gè)，應(yīng)激反應(yīng)1840個(gè)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)1334個(gè)功能組中涉及的Unigenes較多。這一分類(lèi)結(jié)果顯示了大菱鲆熱應(yīng)激過(guò)程中基因表達(dá)譜的總體情況。

2.2.3 Unigenes的KOG功能分類(lèi) 蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(kù)(COG/KOG)對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類(lèi)。研究顯示，大菱鲆腎臟轉(zhuǎn)錄組共獲得17111個(gè)注釋信息，可歸屬于25類(lèi)，并對(duì)每類(lèi)Unigenes進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制為8661個(gè)，一般功能預(yù)測(cè)為6528個(gè)，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶為3346個(gè)，轉(zhuǎn)錄為2435個(gè)，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和小泡運(yùn)輸為2174個(gè)，細(xì)胞構(gòu)架為1925個(gè)，其他類(lèi)別的基因表達(dá)豐度均各不相同(圖3)。

2.2.4 Unigenes的KEGG分析 結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息，進(jìn)一步將大菱鲆腎臟Unigenes進(jìn)行Pathway注釋?zhuān)渲?，?5488個(gè)Unigenes獲得對(duì)應(yīng)的Ko編號(hào)，歸屬于218條代謝通路，分類(lèi)為5類(lèi)KEGG途徑：代謝途徑、遺傳信息處理、細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息和生物系統(tǒng)。其中，代謝途徑主要包括碳水化合物代謝通路、氨基酸代謝通路、能量代謝通路、脂類(lèi)代謝通路、核苷酸代謝通路等，占據(jù)KO注釋Unigenes的25.4%(3941條)；遺傳信息處理主要包括翻譯，折疊、分選和相互作用，轉(zhuǎn)錄，復(fù)制和修復(fù)等，共注釋到1907條Unigenes，占12.3%；細(xì)胞過(guò)程主要由轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝作用，細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡，運(yùn)輸分解代謝，細(xì)胞連接等組成，共注釋到2927條Unigenes，占18.9%；環(huán)境信息主要包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，信號(hào)分子與相互作用，共注釋3230條Unigenes，占20.8%；此外2161條Unigenes被注釋到生物系統(tǒng)中。Unigenes數(shù)量最多的20個(gè)代謝途徑見(jiàn)圖4，涉及細(xì)胞內(nèi)吞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、循環(huán)系統(tǒng)、細(xì)胞連接等。

2.3 CDS分析

通過(guò)Blast比對(duì)得到CDS核酸和氨基酸序列分布，ESTscan預(yù)測(cè)編碼區(qū)的核酸和氨基酸序列的長(zhǎng)度分布(圖5)。

2.4 Unigenes的轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子是能夠結(jié)合在基因上游特異的核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，能調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)大菱鲆腎臟Unigenes進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析，共檢測(cè)到65類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。其中，C2H2鋅指蛋白家族的基因數(shù)目最大，達(dá)到429個(gè)Unigenes；調(diào)節(jié)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)的Homeobox同源異位基因，有101個(gè)Unigenes；與Bhlh家族相關(guān)的有86個(gè)Unigenes；參與抗逆響應(yīng)的TF-Bzip家族相關(guān)的Unigenes有83個(gè)；參與組織損傷修復(fù)、細(xì)胞遷移、再生等生命進(jìn)程的HMG基因有55個(gè)Unigenes；MYB家族42個(gè)，ZBTB家族38個(gè)；Fork-head家族34個(gè)，THR-like家族33個(gè)；其余家族基因數(shù)目相對(duì)較少。

圖2 Unigenes的GO功能分類(lèi)圖

圖3 Unigenes的KOG功能分類(lèi)

圖4 Unigenes的KEGG功能分類(lèi)

圖5 CDS分析

2.5 SSR分析

對(duì)大菱鲆腎臟轉(zhuǎn)錄組的68525條Unigenes進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，共檢測(cè)到21177個(gè)SSR位點(diǎn)。SSR類(lèi)型豐富，其中，包括二堿基、三堿基、四堿基、五堿基和六堿基重復(fù)，各堿基重復(fù)數(shù)量分別為1100、7604、1941、393和231個(gè)。

2.6 基因在大菱鲆不同溫度脅迫中的表達(dá)分析

對(duì)5組不同高溫脅迫環(huán)境(CT: 常溫, T1: 20℃, T2: 23℃, T3: 25℃, T4: 28℃)的基因進(jìn)行表達(dá)比較分析，結(jié)果顯示(圖6)，CT組同4個(gè)高溫組均表現(xiàn)出較大的差異，而且上調(diào)基因占較大比重；T1組與T4組存在較大的差異，差異基因達(dá)到4734個(gè)，其中，上調(diào)基因3386個(gè)，下調(diào)基因1348個(gè)；T1與T3組差異表達(dá)基因163個(gè)，其中，上調(diào)基因131個(gè)，下調(diào)基因32個(gè)；T2與T4組差異基因4157個(gè)，其中，上調(diào)基因2691個(gè)，下調(diào)基因1466個(gè)；T3與T4組差異表達(dá)基因2501個(gè)，其中，上調(diào)基因1673個(gè)，下調(diào)基因828個(gè)；而T1與T2組、T2與T3組的差異表達(dá)基因較少，分別為25和36。

圖6 差異基因統(tǒng)計(jì)

3 討論

作為變溫性動(dòng)物，魚(yú)類(lèi)對(duì)環(huán)境溫度等指標(biāo)要求較嚴(yán)，其中，熱應(yīng)激是影響?hù)~(yú)體生長(zhǎng)發(fā)育最嚴(yán)重的環(huán)境脅迫(周朝偉等, 2018)，魚(yú)類(lèi)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中對(duì)熱應(yīng)激的響應(yīng)形成了一套完善的應(yīng)答協(xié)調(diào)機(jī)制，因此，揭示其熱應(yīng)激脅迫的分子機(jī)制，培育出耐高溫的新品種，在目前全球氣候變暖的背景下顯得尤為迫切。

轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序是功能基因組研究的一個(gè)重要技術(shù)手段，通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)，可以將不同組織、各個(gè)發(fā)育階段以及逆境脅迫下的差異表達(dá)基因快速檢測(cè)出來(lái)，在功能基因組學(xué)研究方面正在發(fā)揮著重要的作用(王申昌等, 2016)。該技術(shù)目前在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用顯著增加，對(duì)于魚(yú)類(lèi)疾病、免疫、生長(zhǎng)、抗逆、系統(tǒng)進(jìn)化和生物毒理過(guò)程及機(jī)理等方面的研究都有極大幫助(陳瓊等, 2014; 陳之航等, 2017)。為盡可能完整、系統(tǒng)地獲得熱應(yīng)激對(duì)大菱鲆腎臟影響的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，本研究選取5個(gè)不同的溫度梯度處理，開(kāi)展了大菱鲆高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組分析。

通過(guò)對(duì)不同溫度脅迫下基因表達(dá)譜結(jié)果進(jìn)行分析，不同溫度組之間存在較顯著的差異，尤其是CT、T1、T3和T4組，4個(gè)溫度組的差異表達(dá)基因較多，而T2與T1、T3組之間的差異基因個(gè)數(shù)較少。我們推測(cè)，隨著溫度的升高，魚(yú)體的生理機(jī)能發(fā)生不斷的變化從而適應(yīng)脅迫，當(dāng)?shù)竭_(dá)某個(gè)溫度區(qū)域時(shí)，機(jī)體將處于一個(gè)平衡態(tài)，機(jī)體變化相對(duì)較小，但如果溫度繼續(xù)升高，則打破這一平衡，繼續(xù)調(diào)整，從而適應(yīng)脅迫。

逆境條件下，許多脅迫相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平都會(huì)有所增加，其主要原因是轉(zhuǎn)錄因子對(duì)目標(biāo)基因啟動(dòng)子的順式作用元件的特異結(jié)合(趙麗娟等, 2016)。本研究對(duì)大菱鲆腎臟熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了分析，共檢測(cè)到65類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，為深入研究大菱鲆熱應(yīng)激適應(yīng)機(jī)制提供分子基礎(chǔ)和依據(jù)。其中，C2H2鋅指蛋白家族的基因數(shù)目最多，其又稱(chēng)為T(mén)FIIIA類(lèi)型的鋅指蛋白(TFIIIA因子是RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄5S rRNA基因所必需)，在真核細(xì)胞中廣泛富集的鋅指蛋白之一(Laity, 2001)。在植物中研究較多，主要參與脅迫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞過(guò)程，如ZAT7基因在鹽脅迫下的表達(dá)主要在根中有所增高(Yilmaz, 2007); TFⅢA型鋅指蛋白SCOF-1，作為冷調(diào)控基因(Cold-regulated, COR)的正調(diào)節(jié)物，通過(guò)與脫落酸效應(yīng)元件相互作用來(lái)調(diào)控COR，增強(qiáng)植物的耐寒能力(Kim, 2001)；從牽?；ㄖ械玫降匿\指蛋白ZPT2-3，其在植物體內(nèi)的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)耐寒能力(Sugano, 2003)。在人類(lèi)疾病方面也有相關(guān)的研究報(bào)道，其對(duì)信號(hào)通路的下游基因表達(dá)有著明顯的調(diào)控作用，可以選擇性結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等(雷陳, 2010)。但在水生生物中的研究卻極少，本文研究結(jié)果顯示，高溫脅迫條件下，C2H2鋅指蛋白家族Unigene數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他轉(zhuǎn)錄因子，其中，差異表達(dá)基因數(shù)為108個(gè)，表明C2H2鋅指蛋白家族的部分基因在大菱鲆熱脅迫條件下發(fā)生表達(dá)水平的變化，哪些基因與熱應(yīng)激相關(guān)？這些基因是如何參與脅迫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的？目前，在海水魚(yú)類(lèi)未見(jiàn)報(bào)道，本課題組將在今后的研究中繼續(xù)深入開(kāi)展。

本研究首次利用Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大菱鲆腎臟組織在5個(gè)不同溫度脅迫條件下的cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，建立了大菱鲆熱應(yīng)激腎臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，相關(guān)數(shù)據(jù)更加完整、系統(tǒng)，為今后開(kāi)展海水魚(yú)類(lèi)熱應(yīng)激脅迫分子調(diào)控機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐，也為耐高溫選育工作提供更多新的功能基因和分子標(biāo)記。

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Transcriptome Study of Kidney of Turbot under High-Temperature Stress

YANG Kai1,2,3, HUANG Zhihui1,3, MA Aijun1,3①, LIU Xiaofei1,3, YANG Shuangshuang1,3

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Shandong Key Laboratory of Marine Fisheries Biotechnology and Genetic Breeding; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3.Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

Inordertoexplorethemolecularmechanism of high-temperature tolerance in turbot,L., and to screen heat tolerance related genes, the IlluminaHiSeq-2500 platform was used to sequence the transcriptome of five turbot kidneys from five different heat treatments, through bioinformatics analysis, including GO (gene function annotation), SSR (simple repeat sequence) analysis, etc. The main results obtained were as follows: the total number of Unigenes obtained by assembly was 68525, the length range was 201~23456 bp, the average length was 1124 bp, and the length of N50 was 2316 bp. Sequence alignment and function annotation of Unigenes was conducted in Nr, Swissprot, KEGG, KOG, and GO databases. A total of 25,498 clusters were obtained, of which the Nr database noted the most Unigenes; and according to GO function classification, had three kinds of cell components, molecular functions, and biological processes, including 56 functional groups. A large number of Unigenes were related to cell processes, metabolic processes, catalytic activities, biological regulation, and stress response. Further, Unigenes were classified into 218 metabolic pathways and five KEGG pathways: metabolic pathway, genetic information processing, cellular processes, environmental information, and biological systems. A total of 65 transcription factors were detected by transcription factor analysis, with the C2H2 Zn finger protein family having the highest number of genes. Through the analysis of gene expression profiles under different temperature stress, there were significant differences among different temperature groups, In the 20℃and 28℃groups, the difference was the largest; 4734 genes, of which 3386 were up-regulated and 1348 were down-regulated. In this study, we established a database of renal transcriptional groups in turbot under heat stress, which provides abundant data for the study of molecular mechanisms of heat stress in turbot.

Turbot; Kidney; Hyperthermia stress; Transcriptome; Bioinformatics analysis

S917.4

A

2095-9869(2020)01-0086-10

10.19663/j.issn2095-9869.20181211001

* 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)(CARS-47-G01)、青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室“鰲山人才”培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2017ASTCP-OS04)、國(guó)家自然基金項(xiàng)目(41706168)、山東省良種工程(2016LZGC031)和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2016HY-JC0302)共同資助 [This work was supported by Modern Agricultural Industry Technology System (CARS-47-G01), Aoshan Talents Cultivation Program Supported by Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao) (2017ASTCP-OS04), National Natural Science Foundation of China (41706168), Good Seed Project of Shandong Province (2016LZGC031), and Chinese Academy of Fishery Sciences Basal Research Fund Under Contract (2016HY-JC0302)] 楊 凱, E-mail: 791590743@qq.com

馬愛(ài)軍，研究員, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn

2018-12-11,

2019-01-03

http://www.yykxjz.cn/

楊凱, 黃智慧, 馬愛(ài)軍, 劉曉菲, 楊雙雙. 高溫脅迫條件下大菱鲆腎臟轉(zhuǎn)錄組研究. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(1): 86–95

Yang K, Huang ZH, Ma AJ, Liu XF, Yang SS. Transcriptome study of kidney of turbot under high-temperature stress. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(1): 86–95

MA Aijun, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn

(編輯 馮小花)