黃華毅 于地美 黃詠槐 黃煥華 田呈明

(1.廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520；2.中國國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查合作中心，北京 100083；3.北京林業(yè)大學(xué)/省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

植物病原細(xì)菌是引起植物病害發(fā)生的重要病原菌之一，能引起多種植物病害且危害寄主廣泛[1]。歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌（Lonsdalea quercina）是一種破壞性極強(qiáng)的病原細(xì)菌，能導(dǎo)致楊樹側(cè)枝和主干發(fā)生潰瘍腐爛，嚴(yán)重的導(dǎo)致側(cè)枝甚至整株死亡[2]。丁香假單胞菌（Pseudomonassyringae）是獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的病原菌，可引起獼猴桃莖干和藤形成潰瘍，阻斷植株養(yǎng)分的正常運(yùn)輸，最終導(dǎo)致植株整株枯死[3]。軟腐歐文氏菌（Erwiniacarotovora）是一種引起白菜發(fā)生軟腐病的病原菌[4]。核桃黃極毛桿菌（Xanthomonasjuglandis）引起的核桃細(xì)菌性褐斑病主要危害核桃的幼果、嫩梢和葉片，尤以幼果危害最為嚴(yán)重[5]。目前，控制植物病原細(xì)菌感染和傳播主要還是應(yīng)用化學(xué)藥劑，然而，長期且過度使用耐降解的化學(xué)藥劑會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染、生態(tài)破壞，同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)植物病原菌產(chǎn)生抗性[6]。因此，開發(fā)和應(yīng)用環(huán)境友好型的替代防治方法以減少對(duì)化學(xué)藥劑的依賴一直是植物保護(hù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在眾多的替代防治方法當(dāng)中，生物防治無疑是一種富有前景的防治方法，使用拮抗微生物可以有效控制植物病原菌，同時(shí)對(duì)環(huán)境和生態(tài)也更加安全[7]。

菌株XZQ-20 是從黑楊（Populus nigra）根際土壤中分離得到的一株拮抗細(xì)菌，本研究測定了菌株XZQ-20 及其無菌培養(yǎng)濾液對(duì)4 種植物病原細(xì)菌的拮抗活性，并對(duì)其產(chǎn)生細(xì)胞壁裂解酶的特性進(jìn)行測定。最后，基于傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)的手段對(duì)菌株XZQ-20 進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試拮抗細(xì)菌XZQ-20 菌株分離自黑楊根際土壤。供試4 種靶標(biāo)植物病原細(xì)菌菌株：歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌、丁香假單胞菌、軟腐歐文氏菌和核桃黃極毛桿菌，用于拮抗菌株XZQ-20 的拮抗活性的測定。

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：用于細(xì)菌菌株的平板培養(yǎng)和斜面保存；LB 液體培養(yǎng)基：用于細(xì)菌菌株菌液的制備；MLM 培養(yǎng)基（葡萄糖20 g，酵母浸粉2 g，谷氨酸5 g,KH2PO42 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,NH4Cl 0.835 g,CuSO40.16 mg,(NH4)2SO41 g,NaNO21.077 g,NaCl 3.083 g,KCl 0.5 g,FeSO40.15 mg，MnSO4·H2O 0.45 mg,pH 7.0）：用于拮抗細(xì)菌XZQ-20 的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3 種子液的制備

挑取活化后的菌株XZQ-20 或植物病原細(xì)菌的單菌落，接種至裝有100 mL 的LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶（規(guī)格250 mL）中，于30°C，200 r·min-1的條件下震蕩培養(yǎng)24 h 獲得種子液，將種子液濃度調(diào)整為1.0 × 107cfu·mL-1后備用。

1.4 菌株XZQ-20 無菌培養(yǎng)濾液的制備

事先制備好菌株XZQ-20 的種子液，按照1%（v·v-1）的接種量接種至裝有100 mL MLM 培養(yǎng)基的三角瓶（規(guī)格500 mL）中，于30 °C、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)5 d。然后在4 °C、12 000 r·min-1的條件下離心30 min 后收集上清液，再用0.45 μm 微孔濾膜過濾，得到菌株XZQ-20 的無菌培養(yǎng)濾液。

1.5 菌株XZQ-20 對(duì)植物病原細(xì)菌的拮抗活性

事先制備好的植物病原細(xì)菌種子液，按1:10（v·v-1）的比例分別與加熱冷卻至45-50°C 的LB固體培養(yǎng)基混勻，倒平板（規(guī)格9 cm），待平板冷卻凝固后，挑取活化后的菌株XZQ-20 的單菌落接種于混合了植物病原細(xì)菌的LB 平板上，接種點(diǎn)距平板中心2.5 cm，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻接種3 個(gè)點(diǎn)，在30°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后測量抑菌圈直徑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 菌株XZQ-20 的無菌培養(yǎng)濾液對(duì)植物病原細(xì)菌的拮抗活性

菌株XZQ-20 無菌培養(yǎng)濾液的拮抗活性的測定采用濾紙片法[8]。事先制備好的植物病原細(xì)菌種子液，按1:10（v·v-1）的比例分別與加熱冷卻至45-50°C 的LB 固體培養(yǎng)基混勻，倒平板（規(guī)格9 cm），待平板冷卻凝固后，將直徑為6 mm 的無菌濾紙片置于平板上，距平板中心2.5 cm，每個(gè)平板均勻放置3 個(gè)無菌濾紙片。采取逐滴滴加的方法往不同濾紙片上分別滴加40 μL 的無菌培養(yǎng)濾液，以滴加等量的無菌水作為對(duì)照組，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后測量抑菌圈直徑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 菌株XZQ-20 產(chǎn)細(xì)胞壁裂解酶特性測定

菌株XZQ-20 產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、蛋白酶和脂酶的特性測定分別采用文獻(xiàn)[9-12]中的方法。

1.8 菌株XZQ-20 的鑒定

1.8.1 形態(tài)及生理生化指標(biāo)測定 參照文獻(xiàn)[6,12-13]的方法對(duì)菌株的形態(tài)和生理生化特征進(jìn)行測定，包括細(xì)菌形狀、大小、革蘭氏染色、接觸酶、淀粉水解、明膠液化等指標(biāo)。

1.8.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 采用菌落PCR 法擴(kuò)增16S rDNA[14]：挑取單菌落至裝有500 μL 無菌去離子水的EP 管中，100 °C 煮沸10 min 后，12 000 r·min-1、2 min 離心取上清液，即為菌株的基因組DNA。以提取的菌株基因組DNA 為模板，利用引物fD1：5’-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，rD1：5’-CCCGGGATCCAAG-CTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3’[15]，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL，含有2×ES Taq MasterMix 12.5 μL、引物fD1 和rD1 各1 μL、DNA 模 板1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件：94 °C 3 min；94 °C 1 min，52 °C 1 min，72 °C 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min。引物合成和測序由英濰捷基(北京)貿(mào)易有限公司完成。采用BLAST 方法在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索和同源性比較，采用ClustalX 1.8 進(jìn)行序列匹配分析，通過MEGA 5.0 軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育，用Bootstrap (重復(fù)抽樣1 000 次)分析評(píng)估樹的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株XZQ-20 對(duì)植物病原細(xì)菌的拮抗活性

培養(yǎng)3 d 后，菌株XZQ-20 對(duì)4 種植物病原細(xì)菌均表現(xiàn)出了較好的拮抗活性，其抑制歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌、丁香假單胞菌、軟腐歐文氏菌和黃極毛桿菌形成的抑菌圈直徑分別達(dá)到（11.75±1.06）mm，（13.3±2.26）mm，（16.75±0.07）mm 和（7.55±1.06）mm（圖1）。菌株XZQ-20 已被保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（保藏號(hào)：CGMCC NO.12556）。

圖1 菌株XZQ-20 活菌體對(duì)植物病原細(xì)菌的拮抗活性Figure 1 Antagonistic activities of viable bacteria of strain XZQ-20 against plant pathogenic bacteria

2.2 菌株XZQ-20 無菌培養(yǎng)濾液對(duì)植物病原細(xì)菌的拮抗活性

不同種類的4 種植物病原細(xì)菌（L.quercina,P.syringae,E.carotovora和X.juglandis）用于測定菌株XZQ-20 的無菌培養(yǎng)濾液的拮抗活性，結(jié)果顯示培養(yǎng)3 d 后抑菌圈直徑分別達(dá)到（8.18±0.75）mm，（7.63±0.88）mm，（8.03±0.93）mm 和（8.60±0.53）mm（圖2）。

圖2 菌株XZQ-20 的無菌培養(yǎng)濾液對(duì)植物病原細(xì)菌的拮抗活性Figure 2 Antagonistic activities of sterile culture filtrate of strain XZQ-20 against plant pathogenic bacteria

2.3 菌株XZQ-20 產(chǎn)細(xì)胞壁裂解酶特性

菌株XZQ-20 產(chǎn)5 種細(xì)胞壁裂解酶特性測定結(jié)果表明，在培養(yǎng)了4 d 后，只有脫脂牛奶培養(yǎng)基平板上的XZQ-20 菌體周圍產(chǎn)生了透明圈（圖3），而其他裂解酶測定平板中菌體周圍未見透明圈或暈圈出現(xiàn)，表明菌株XZQ-20 能產(chǎn)生蛋白酶。

圖3 菌株XZQ-20 產(chǎn)蛋白酶活性Figure 3 The protease activity of strain XZQ-20

2.4 菌株XZQ-20 的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性 菌株XZQ-20在LB 平板上呈乳白色，不透明，菌落圓形、光滑，邊緣隆起、完整，菌體粘稠（圖 4 A）。菌體為桿狀，大小約0.80～2.03 μm×2.75～7.49 μm，有芽孢，具鞭毛，革蘭氏陽性菌（圖 4 B）。兼性厭氧型，能夠利用葡萄糖、D-木糖，甘露醇和檸檬酸鹽，能水解葡萄糖產(chǎn)氣，明膠液化，硝酸鹽還原、硫化氫反應(yīng)、氧化酶反應(yīng)、卵磷脂酶活性、淀粉水解均呈陽性，而Voges-Proskauer 反應(yīng)，吲哚反應(yīng)，甲基紅反應(yīng)和苯丙氨酸脫氨酶活性均呈陰性。菌株能在溫度范圍10～41°C，pH 范圍4～8和NaCl 濃度范圍0.2%～3%之間生長（表 1）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性將菌株XZQ-20 初步鑒定為深層類芽孢桿菌（Paenibacillus profundus）。2.4.2 16S rDNA 序列測定及分析 菌株XZQ-20的16S rDNA PCR 擴(kuò)增得到一段大小為1 481 bp 的基因片段，系統(tǒng)發(fā)育分析（圖5）結(jié)果顯示，菌株XZQ-20 與P.profundusSl 79（AB712351）接近。綜合菌株XZQ-20 的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA 序列分析結(jié)果，最終將菌株XZQ-20鑒定為深層類芽孢桿菌。

表1 菌株XZQ-20 的生理生化特性Table 1 Physiology-biochemical characteristics of strain XZQ-20

圖4 菌株XZQ-20 的菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色（B）Figure 4 Colony morphology (A) and gram staining (B) of strain XZQ-20

圖5 菌株XZQ-20 16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 5 Phylogenetic tree of strain XZQ-20 based on 16S rDNA sequence analysis

3 結(jié)論與討論

類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）是最為重要的生物防治菌株資源之一，能廣泛且有效地拮抗植物病原真菌和植物病原細(xì)菌。從辣椒（Capsicum annuum）田土壤中分離得到一株愛媛類芽孢桿菌（P.ehimensis）KWN38 能有效抑制立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）的生長[7]。多粘類芽孢桿菌（P.polymyxa）CF05 對(duì)引起鐵皮石斛（dendrobium officinalis）葉斑病的萎蔫短小桿菌（Curtobacterium flaccumfaciens）具有較高的拮抗活性[16]。在本研究中，分離自黑楊根際土壤中的菌株XZQ-20 被鑒定為深層類芽孢桿菌（P.profundus），其對(duì)歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌、丁香假單胞菌、軟腐歐文氏菌和黃極毛桿菌均表現(xiàn)出了較好的拮抗活性。由此看出，菌株XZQ-20具有開發(fā)成控制植物病原細(xì)菌引起的植物病害的生防菌劑的潛力。

大量的研究報(bào)道表明類芽孢桿菌屬的細(xì)菌能產(chǎn)生不同種類的拮抗活性物質(zhì)，包括脂肽類、蛋白類和揮發(fā)性氣體等，這些拮抗活性物質(zhì)具有較廣的抑菌譜。從愛媛類芽孢桿菌KWN38 的無菌培養(yǎng)濾液中提取的粗蛋白和丁醇提取物均能破壞立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和辣椒疫霉菌的菌絲，此外，菌株KWN38 產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體也具有拮抗活性，同時(shí)還具有較強(qiáng)的幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、葡聚糖酶和蛋白酶活性[7]。多粘類芽孢桿菌HKA-15 產(chǎn)生的抑菌脂肽能有效抑制野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) M-5 的生長[17]。多粘類芽孢桿菌JSa-9 產(chǎn)生的拮抗蛋白表現(xiàn)出了較廣的拮抗細(xì)菌和真菌的活性[18]。在本研究中，菌株XZQ-20 的無菌培養(yǎng)濾液表現(xiàn)出了較強(qiáng)的拮抗活性，這說明在菌株XZQ-20 的無菌培養(yǎng)濾液中存在著拮抗活性物質(zhì)。此外，還發(fā)現(xiàn)菌株XZQ-20 能產(chǎn)蛋白酶，而產(chǎn)生的蛋白酶可能會(huì)破壞病原細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，這也有可能是菌株XZQ-20 對(duì)不同種類的植物病原細(xì)菌均表現(xiàn)出拮抗活性的原因之一。

本研究結(jié)果表明菌株XZQ-20 是一株具有較強(qiáng)拮抗活性的細(xì)菌菌株，其活菌體和無菌培養(yǎng)濾液均能有效抑制多種病原細(xì)菌的生長。此外XZQ-20 還能產(chǎn)生蛋白酶。最后，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA 序列分析，將拮抗菌株XZQ-20 鑒定為深層類芽孢桿菌。綜上所述，拮抗菌株XZQ-20 是一株潛在的植物病原細(xì)菌的生防菌劑。