曾家城 秦長(zhǎng)生 趙丹陽 徐金柱 楊 華 田龍艷 邱華龍

(1.廣東省肇慶市廣寧縣林業(yè)局，廣東 肇慶 526500;2.廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520）

油茶（Camellia oleifera）是世界四大木本油料之一，是中國特有的一種純天然高級(jí)油料，在林業(yè)、農(nóng)漁、食療、醫(yī)藥、化工、日化、輕紡等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[1]。利用油茶果壓榨出的茶油健康營養(yǎng)，氣味清香，不僅不含芥酸、膽固醇、黃曲霉素等對(duì)人體有害的物質(zhì)，而且具有抵抗紫外、延緩衰老、美容養(yǎng)顏、促進(jìn)傷口愈合等諸多功效，被外界稱贊為“世界上最好的食用油”[2-3]。隨著茶油深加工技術(shù)的快速成熟發(fā)展，我國油茶種植、生產(chǎn)、深加工一體化全產(chǎn)業(yè)鏈體系正逐步形成并初具規(guī)模。根據(jù)國家林業(yè)局編制的《全國油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2009-2020）》，至2020 年全國油茶林面積將達(dá)到467 萬hm2。隨著油茶林面積和規(guī)模不斷擴(kuò)大，油茶病蟲害的發(fā)生與危害也成日趨嚴(yán)重的態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重影響油茶的產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)山區(qū)油茶產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展和全面實(shí)現(xiàn)小康造成巨大威脅[4-6]。

油茶專性蛀果害蟲油茶象甲（Curculio chinensis）的發(fā)生和危害是造成油茶低產(chǎn)低質(zhì)的重要原因之一[7]。油茶象甲屬于鞘翅目象甲科，廣泛分布于我國云、貴、桂、浙、湘、贛、粵等油茶主產(chǎn)區(qū)，其蟲態(tài)和危害狀如圖1 所示。油茶象甲成蟲將卵產(chǎn)在油茶幼果的果仁內(nèi)，卵孵化為幼蟲后，幼蟲蛀食果仁，果仁被食一空，導(dǎo)致油茶果早衰和落果。油茶象甲不僅產(chǎn)卵量較多，平均單頭雌蟲可產(chǎn)卵163 粒，而且為害期長(zhǎng)，平均每年發(fā)生危害長(zhǎng)達(dá)200 天左右[7]。油茶象甲幼蟲隱蔽在油茶果內(nèi)部蛀食果仁，當(dāng)油茶果顯示出癥狀時(shí)已暴發(fā)成災(zāi)，而化學(xué)藥劑不容易滲透到果實(shí)內(nèi)部，只有加大藥劑使用量才能勉強(qiáng)提高防效。油茶作為木本油料樹種，為社會(huì)提供健康營養(yǎng)的食用油料，大量使用化學(xué)藥劑勢(shì)必將危害人類的身體健康。因此，研究并應(yīng)用更為安全、高效、無殘留的油茶象甲防治技術(shù)勢(shì)在必行。

圖1 油茶象甲蟲態(tài)及發(fā)生危害示意Fig. 1 Schematic diagrams of developmental states and its damaging phenomenon of Curculio chinensis

在昆蟲與寄主植物的關(guān)系中，昆蟲主要通過密布在觸角上的化學(xué)感受器接收和識(shí)別植物源氣味進(jìn)行取食、寄主定位或產(chǎn)卵選擇[8]。利用昆蟲與植物的化學(xué)通訊機(jī)制進(jìn)行害蟲的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及防治策略已在農(nóng)林生產(chǎn)中得到應(yīng)用：例如馬鈴薯（Solanum tuberosum）拉丁名釋放的揮發(fā)物α-蒎烯、α-石竹烯、β-石竹烯、檸檬烯、月桂烯和煙堿對(duì)馬鈴薯塊莖蛾（Phthorimaea operculella）的產(chǎn)卵具有顯著的引誘作用，并依據(jù)該特性成功研發(fā)出馬鈴薯塊莖蛾植物源高效引誘劑[9]。目前尚未見有關(guān)油茶象甲通過揮發(fā)物定位識(shí)別寄主植物的報(bào)道，因此，本研究分析了油茶果實(shí)揮發(fā)物對(duì)油茶象甲的電生理和行為反應(yīng)，為油茶象甲引誘劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 油茶象甲采集與飼養(yǎng)

于2018 年4—8 月在廣東省韶關(guān)市曲江區(qū)小坑林場(chǎng)和樂昌市龍山林場(chǎng)采集油茶象甲。利用油茶象甲成蟲假死性的特征，采用振落法捕捉油茶象甲成蟲。首先在進(jìn)油茶樹底下平鋪一層白色的細(xì)紗網(wǎng)，然后搖晃油茶樹，待油茶象甲掉落到細(xì)紗網(wǎng)上，將其放入養(yǎng)蟲籠中并帶回實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度80%左右、光周期L:D=12 h:12 h，隔天喂食洗凈的油茶鮮果。

1.2 油茶象甲對(duì)油茶果實(shí)揮發(fā)物的觸角電位測(cè)試

將表面洗凈晾干的油茶果實(shí)（贛州油茶，果實(shí)長(zhǎng)度3～5 cm，寬度2～4 cm）放在色譜純的正己烷中浸泡10 min 收集油茶果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)，加入正十八烷作為內(nèi)標(biāo)，用無水硫酸鈉去除多余水分后，用帶過濾膜的移液器將樣品轉(zhuǎn)移到2 mL樣品瓶?jī)?nèi)，并用氮吹儀濃縮到適合的濃度，保存在-20 ℃冰箱內(nèi)待用。用GC-EAD 方法測(cè)試油茶象甲觸角對(duì)油茶果實(shí)揮發(fā)物的觸角電生理反應(yīng)。氣相色譜型號(hào)為安捷倫7890B，色譜條件為：HP-5 (30 m,0.25 mm 內(nèi)徑,0.25 μm 膜厚) 毛細(xì)管色譜柱，載氣為高純氮?dú)?，進(jìn)樣口溫度250℃，檢測(cè)器280℃，柱箱升溫程序?yàn)?0 ℃保留3 min、10 ℃/min升至250℃并保留5 min。利用荷蘭Syntech 公司的EAG 昆蟲觸角電位記錄儀測(cè)定揮發(fā)物引起昆蟲的觸角電生理反應(yīng)大小。沿油茶象甲觸角基部將觸角剪下，并在觸角尖部切開0.5 mm，然后將觸角連接到觸角電位儀的兩個(gè)蘸有導(dǎo)電膠的電極上。GC 和EAG 的樣品分流比為1:1。采用手動(dòng)不分流進(jìn)樣模式進(jìn)樣1 μL，測(cè)試油茶象甲的觸角電位反應(yīng)。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 根觸角以上。

1.3 活性揮發(fā)物的鑒定

用安捷倫氣相質(zhì)譜（GC-MS：7890B-5977B）對(duì)油茶果實(shí)中對(duì)油茶象甲具有電生理活性的揮發(fā)物進(jìn)行鑒定。GC 的進(jìn)樣口溫度、升溫條件、色譜柱規(guī)格、柱流量等色譜條件和GC-EAD 實(shí)驗(yàn)中的相同，進(jìn)樣分流比為30:1。MS 條件為：傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，離子掃描范圍50～300。根據(jù)NIST17 普庫中的特征離子片段對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，同時(shí)購買標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。

1.4 油茶象甲對(duì)活性揮發(fā)物的行為反應(yīng)測(cè)試

利用Y 型嗅覺儀測(cè)試單頭油茶象甲對(duì)鑒定的揮發(fā)物的行為反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中，分別測(cè)試雌油茶象甲對(duì)0.1、1、10 和100 ng/μL 正十八烷和油酸酰胺（溶于正己烷當(dāng)中）的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)過程中，在Y 型嗅覺儀的一個(gè)臂中加入蘸有活性物質(zhì)的濾紙作為處理，另一臂中加入蘸有正己烷的濾紙作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)過程中保持氣流流速為1.2 L/min。雌蟲放入Y 型管中觀察5 min，當(dāng)雌蟲進(jìn)入Y 型管一側(cè)超過3 cm 且停留時(shí)間超過1 min 則記為一個(gè)有效選擇。實(shí)驗(yàn)過程中只統(tǒng)計(jì)有效選擇的蟲數(shù)。在進(jìn)行5 個(gè)有效重復(fù)后，將裝置拆解開用酒精進(jìn)行沖洗并烘干，然后再進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)記錄20 個(gè)有效重復(fù)。實(shí)驗(yàn)中將整個(gè)裝置用不透光的黑布罩住，防止光源對(duì)實(shí)蠅的選擇造成影響。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS (version 20) 中的卡方檢驗(yàn)(P＜0.05) 分析Y 型嗅覺儀中處理與對(duì)照間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶果實(shí)中對(duì)油茶象甲具有生理活性揮發(fā)物的篩選和鑒定

GC-EAD 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在15.05、19.30、21.97 和22.79 min 4 個(gè)出峰時(shí)間點(diǎn)，揮發(fā)物能夠引起油茶象甲較強(qiáng)的觸角電生理反應(yīng)（圖2）。因此，將這4 個(gè)物質(zhì)作為備選活性物質(zhì)。通過GC-MS 分析和NIST 譜庫比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在15.05 min 出峰時(shí)間的物質(zhì)，判定為正十八烷，在19.30 min 出峰的物質(zhì)判定為油酸酰胺，另外兩個(gè)出峰時(shí)間的物質(zhì)由于比對(duì)相似性較低，暫時(shí)無法鑒定。正十八烷和油酸酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的GC 出峰時(shí)間分別為15.04 和19.28 min，和GC-EAD 中測(cè)試的出峰時(shí)間基本一致。通過GC-MS 質(zhì)譜圖比較分析，確定這兩個(gè)時(shí)間出峰的物質(zhì)為正十八烷和油酸酰胺（圖3）。

圖2 油茶果實(shí)揮發(fā)物對(duì)油茶象甲的觸角GC-EAD 反應(yīng)圖Fig. 2 Electroantennogram of antennae of Curculio chinensis to volatiles of Camellia oleifera fruits

圖3 對(duì)油茶象甲具有電生理活性的兩種揮發(fā)物（a 正十八烷；b 油酸酰胺）的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectrograms of (a) n-Octadecane and (b) Oleamide that induce antennae response of Curculio chinensis

2.2 油茶象甲對(duì)不同濃度活性揮發(fā)物的行為選擇

Y 型嗅覺儀選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.1 和1 ng/μL的正十八烷對(duì)油茶象甲具有較強(qiáng)的驅(qū)避作用（0.1 ng/μL:c2=9.29，P=0.007;1 ng/μL:c2=14.23，P＜0.001），但是油茶象甲對(duì)10 ng/μL 和100 ng/μL 濃度的十八烷沒有顯著趨性（P＞0.05,圖4）。1 ng/μL的油酸酰胺對(duì)油茶象甲具有較強(qiáng)的吸引作用（c2=15.52，P＜0.001），其它3 個(gè)濃度多油茶象甲無顯著引誘作用（P＞0.05,圖4）。

圖4 油茶象甲對(duì)不同濃度正十八烷和油酸酰胺的選擇行為Fig. 4 Selection of Curculio chinensis to different concentration of n-Octadecane and Oleamide

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)油茶果實(shí)中有4 種化合物能夠引起油茶象甲的觸角電生理反應(yīng)，通過GC-MS 分析和購買標(biāo)準(zhǔn)品，確定了其中兩種化合物正十八烷和油酸酰胺。本研究首次報(bào)道了油茶果實(shí)揮發(fā)物和油茶象甲選擇行為之間的關(guān)系，對(duì)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)油茶象甲蟲對(duì)寄主進(jìn)行取食產(chǎn)卵的行為具有重要意義。

研究結(jié)果表明，中濃度的油酸酰胺對(duì)油茶象甲產(chǎn)卵具有引誘效果，而在低濃度和高濃度下這種引誘效果減弱或消失，這說明油茶象甲對(duì)油酸酰胺的嗅覺反應(yīng)強(qiáng)弱取決于化合物濃度大小。這種揮發(fā)物對(duì)昆蟲行為的濃度劑量效應(yīng)在其它昆蟲中也有報(bào)道。例如，低濃度的β-石竹烯能夠引誘斑翅果蠅（Drosophila suzukii）雌成蟲進(jìn)行產(chǎn)卵，而高濃度下則表現(xiàn)為產(chǎn)卵驅(qū)避效果，并且隨著濃度升高，斑翅果蠅的產(chǎn)卵量逐漸降低[10]。已有研究表明許多植物的揮發(fā)物中含有油酸酰胺，例如金線蘭（Anoectochilus roxburghii）、燕麥（Avena sativa）、虎舌紅（Ardisia mamillata）、茭白（Zizania latifolia）等[11-14]，表明油酸酰胺是一類廣泛存在植物當(dāng)中的揮發(fā)物，可能對(duì)多種昆蟲具有一定的生理活性。

有研究報(bào)道瓜蚜（Aphis gossypii）為害黃瓜后會(huì)誘導(dǎo)植株釋放正十八烷[15]，被黑條矮縮病毒危害的稻株會(huì)誘導(dǎo)釋放出正十八烷[16]。然而，這些蟲害或者病害誘導(dǎo)釋放的揮發(fā)物是否能夠驅(qū)避害蟲繼續(xù)為害或者引誘害蟲天敵，目前還不清楚。本研究中的中低濃度正十八烷對(duì)油茶象甲具有較強(qiáng)的驅(qū)避作用，說明正十八烷可能是植物用來防御害蟲取食危害的一種手段。由于本研究中是用正己烷浸提的辦法提取化合物，因此，油菜果實(shí)在蟲害或機(jī)械損傷下能否誘導(dǎo)還不清楚。因此，在接下來的研究中，將探索更合適的方法，例如通過固相微萃取等技術(shù)，比較研究油茶在健康、蟲害及機(jī)械損傷等條件下的揮發(fā)物差異。

在通過調(diào)控昆蟲行為進(jìn)行害蟲防治的方法中有一種叫做推拉策略，“推”是指在林地或作物田內(nèi)，利用行為驅(qū)避劑驅(qū)離害蟲；“拉”是指在林地外緣或作物田邊，利用害蟲引誘劑吸引害蟲，并將害蟲集中消滅[17]。油茶象甲對(duì)不同濃度正十八烷和油酸酰胺表現(xiàn)出的驅(qū)避和引誘的不同行為反應(yīng)則為利用推拉策略防治油茶象甲提供了一種新的思路，但該推拉策略還需要進(jìn)一步野外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。