孫衛(wèi)民，康嘉樂，鄧 聰，林 敏，任鵬麗

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510260

金標免疫層析試驗作為一種臨床快速檢測技術，因其省去了標本預處理步驟，以及大型儀器設備檢測、數(shù)據(jù)處理和傳輸?shù)却罅糠爆嵉倪^程，可直接快速地得到可靠的結果，廣泛應用于臨床。目前床旁金標免疫層析試紙條大多采用肉眼直接判讀，結果易受標本中的水或血、標記物納米金等滲透不均的干擾，且大多適用于定性或半定量檢測，使其應用范圍受到一定限制[1-2]。由于納米金顆粒直徑偏小，影響肉眼觀察的靈敏度。因此，該技術雖然操作簡便、成本低，但其靈敏度不夠高，易導致誤檢和漏檢，留下安全隱患。為提高金標免疫層析試驗的靈敏度，有研究通過生物素親和素系統(tǒng)，免疫金銀染色法進行銀加強試驗，對膜進行化學修飾和對二抗進行修飾制作增敏劑等技術，在一定程度上提高了試驗的靈敏度[3-5]。但這些方案操作復雜、試驗時間較長、成本高，不太適合實時快速的臨床床邊檢測。因此，構建既靈敏又快速的檢測技術成為亟待攻克的技術難題。本研究以血漿絨毛膜促性腺激素(HCG)金標免疫層析試驗為基礎，以改性溶液做預處理，鹽酸羥胺和抗壞血酸兩種還原劑還原氯金酸制備納米金顆粒，在原位上增大納米金的粒徑，以期提高金標免疫層析試驗靈敏度。比較這兩種化學方法制備納米金的增敏效果，找出相對合適制備納米金增敏金標免疫層析試驗的方法，為提高金標免疫層析試驗靈敏度，擴大臨床應用范圍提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 Precisa240A電子分析天平、金標免疫層析試紙條購自北京藍十字生物藥業(yè)有限公司；鹽酸羥胺(分析純)購自廣州化學試劑公司；抗壞血酸購自湖南省婁底市化學品有限公司；氯金酸(分析純)購自北京化學試劑公司；磷酸鹽緩沖液購自蘇州賽默飛世爾儀器有限公司；吐溫20購自美國Sigma公司；壬基酚聚氧乙烯醚購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2方法

1.2.1改性溶液的配制 100 mL的磷酸鹽緩沖液加入CaCl2和MgCl2使終濃度分別為1.0 mmol/L和0.5 mmol/L，同時加入1 mL吐溫20和1 mL壬基酚聚氧乙烯醚，充分混勻備用。

1.2.2鹽酸羥胺增敏法 A液：用去離子水配制1%的氯金酸；B液：用磷酸鹽緩沖液配制0.4 mol/L鹽酸羥胺。

1.2.3抗壞血酸增敏法 A液：用去離子水配制1%的氯金酸；B液：用磷酸鹽緩沖液配制0.5%抗壞血酸。

1.2.4標本制備 將患者血漿(HCG濃度為256.800 0 mIU/mL)用生理鹽水倍比稀釋為：未稀釋、1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320(濃度依次約：256.800 0 mIU/mL、102.720 0 mIU/mL、51.360 0 mIU/mL、25.680 0 mIU/mL、15.840 0 mIU/mL、6.420 0 mIU/mL、3.210 0 mIU/mL、1.605 0 mIU/mL、0.802 5 mIU/mL)，再以雅培I2000全自動化學發(fā)光免疫分析儀檢測結果為陰性的血漿作為陰性對照。按金標免疫層析試紙條說明書操作檢測，檢測完畢后用照相機拍照存檔。

1.2.5HCG測定增敏下限的確定 待試紙條按1.2.4檢測完畢，將樣品墊、金標墊和上端的吸水紙剪掉，注意不要損傷硝酸纖維素膜。將各試紙條分別放入改性溶液浸泡5 min，取出用去離子水沖洗干凈，用吸水紙吸去多余的水分，讓試紙條保持一定的傾斜角度，先加A液10 μL氯金酸溶液，再加B液80 μL鹽酸羥胺溶液或80 μL抗壞血酸溶液，使其沿試紙條依次通過測試線和控制線，10 min內讀取結果。

1.3統(tǒng)計學處理 采用EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結 果

2.1HCG測定增敏下限的確定試驗 結果表明抗壞血酸組：未增敏前以>25.000 0 mIU/mL為陽性，256.800 0 mIU/mL、102.720 0 mIU/mL、51.360 0 mIU/mL、25.680 0 mIU/mL為弱陽性，其余均為陰性。增敏后以>6.400 0 mIU/mL為陽性，256.800 0 mIU/mL、102.720 0 mIU/mL、51.360 0 mIU/mL、25.680 0 mIU/mL、15.840 0 mIU/mL、6.420 0 mIU/mL均出現(xiàn)陽性帶，且顏色逐漸偏低，3.210 0 mIU/mL、1.605 0 mIU/mL和陰性對照顯示陰性結果。兩次檢測結果比較顯示基于納米金增敏HCG檢測下限可達6.420 0 mIU/mL，相對增敏前，靈敏度提高約4倍。

鹽酸羥胺組：未增敏前以>25.0000 mIU/mL為陽性，256.800 0 mIU/mL、102.720 0 mIU/mL、51.360 0 mIU/mL、25.680 0 mIU/mL為弱陽性，其余均為陰性。增敏后以>6.400 0 mIU/mL為陽性，256.800 0 mIU/mL、102.720 0 mIU/mL、51.360 0 mIU/mL、25.680 0 mIU/mL、15.840 0 mIU/mL、6.420 0 mIU/mL、3.210 0 mIU/mL、1.605 0 mIU/mL均出現(xiàn)陽性帶，且顏色逐漸偏低，0.802 5 mIU/mL和陰性對照顯示陰性結果。兩次檢測結果比較顯示基于納米金增敏HCG檢測下限可達1.605 0 mIU/mL，相對增敏前，靈敏度提高約16倍。

2.2重復性試驗 將6.420 0 mIU/mL、1.605 0 mIU/mL溶液按鹽酸羥胺還原法繼續(xù)用同一批次的金標免疫層析試紙條分別作4份檢測，連續(xù)5 d，檢測結果均穩(wěn)定不變，表明該技術增敏結果重復性較滿意。

3 討 論

金標免疫層析試驗以納米金作為示蹤標記物，把納米金顆粒光學檢測的靈敏度及免疫反應的特異度相結合，應用于抗原抗體反應。因其簡便、快速、安全，在急診醫(yī)學、輸血醫(yī)學、現(xiàn)場診斷及個體自我體檢等方面廣泛應用，是床旁檢驗的主要技術手段。金標免疫層析試紙條的吸水墊處加待測液體樣品，液流向試紙條的測試區(qū)移動，液流經(jīng)過結合釋放區(qū)時，膜上預固的金標特異性抗體(或抗原)被溶解，與待測物反應而形成金標抗原抗體復合物。液流前移至檢測區(qū)，其上的抗體(或抗原)結合并固定納米金標記的復合物，通過納米金標記物濃集呈現(xiàn)紫紅色，為陽性反應[6]。該檢測技術雖優(yōu)勢很突出,但因依靠其自身所具有的顏色進行結果判斷，需顆粒大量聚集達到肉眼可見的效果。臨床中部分標本因水平低，結合的金標抗體少，肉眼觀察時呈現(xiàn)很淺的顏色甚至無法識別，因此判斷為陰性，實則是假陰性結果。因此，該方法檢測靈敏度較低，從而限制了金標免疫層析試紙條在臨床對檢測靈敏度要求較高項目中的應用[7]。

為提高金標免疫層析試紙條的靈敏度,研究人員進行了多方面的嘗試，通過研制產(chǎn)生特定光、電或磁信號的納米材料,增強反應信號，提高增敏效果[8-12]。本研究采用已在臨床使用成熟的HCG試劑為基礎作增敏研究。試驗中未增敏時HCG濃度為15.840 0 mIU/mL、6.420 0 mIU/mL、3.210 0 mIU/mL、1.605 0 mIU/mL均表現(xiàn)為陰性。當使用改性溶液處理金標免疫層析試紙條表面，分別采用鹽酸羥胺與氯金酸和抗壞血酸與氯金酸兩種方式在試紙條原位制備納米金，試紙條檢測區(qū)原本少量的納米金結合新產(chǎn)生的納米金，呈黑褐色，從而放大檢測信號，肉眼可判斷，其中抗壞血酸還原法檢測靈敏度提高約4倍，鹽酸羥胺還原法檢測靈敏度提高約16倍。結果進一步證實了筆者前期原位增敏的推斷[13]。氯金酸水溶液中的金離子在不同還原劑的作用下還原成金原子，并聚集成微小的金核，在其表面吸附負離子(AuCl2-)和部分正離子(H+)形成吸附層，依靠靜電作用形成穩(wěn)定的膠體溶液。使用改性溶液破壞金核表面的吸附層，使新制備的金核與標記單克隆抗體的膠體金顆粒結合，在試紙條的檢測區(qū)形成更大的“金殼”,隨著膠體金粒徑的增大，膠體金顏色加深，表現(xiàn)為黑褐色，從而放大檢測信號，提高肉眼的判讀能力，達到增敏的效果。

本研究提高了肉眼判讀金標結果的靈敏度，但不同判讀者肉眼判讀的主觀性差異較大，判讀結果的誤差也較大，仍存在一些局限性。因此將該增敏方案聯(lián)合特定的免疫檢測儀器，對結果進行判讀，避免肉眼判讀的主觀誤差，以及這兩類增敏方法在不同項目或不同廠家的金標免疫層析技術上的普遍適用性等方面作進一步研究，將更有助于提高其實際應用價值。

綜上所述，快速氧化還原法制備納米金對金標免疫層析試驗有一定增敏效果，不同的還原劑增敏效果不同。其中鹽酸羥胺還原法制備納米金對血漿HCG金標免疫層析試驗相對抗壞血酸還原法增敏倍數(shù)較高，重復性較好，試驗結果可靠，更加適合用于制備納米金以達到增敏金標免疫層析試驗的目的，為擴大金標免疫層析試驗的應用范圍提供一定的基礎。