馬莉莉，張樹麗，李 琴，許 彭，封 敏，李秀梅，

(1．新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011；2．新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011；3．新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；4．新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011)

作為非編碼RNA(non-coding RNA)家族新成員之一的miRNA是一類長度為21～23個核苷酸的調(diào)控性小RNA分子，存在于多種生物基因組內(nèi)。它可通過mRNA剪切和抑制蛋白質(zhì)翻譯的方式調(diào)控靶基因，調(diào)節(jié)約50%的蛋白編碼基因。研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，miRNA與相應(yīng)的蛋白結(jié)合后參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種病理過程，它的表達(dá)失控與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，引起包括其調(diào)控的靶基因以及相關(guān)的重要信號通路組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生異常，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生或進(jìn)展。因此，研究腫瘤發(fā)生相關(guān)miRNA的表達(dá)及功能是當(dāng)今腫瘤發(fā)生機(jī)制研究熱點(diǎn)之一。miRNA基因芯片具有高效率、高通量特點(diǎn)，已作為重要的技術(shù)應(yīng)用于疾病發(fā)生的研究領(lǐng)域。食管癌作為嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，死亡率高，生存率低，發(fā)生機(jī)制仍在摸索中[3]。本研究采用miRNA表達(dá)譜基因芯片方法篩選新疆哈薩克族食管癌組織與遠(yuǎn)端正常組織中差異表達(dá)的miRNAs后，選取部分差異表達(dá)的miRNAs在47例新疆哈薩克族食管癌組織與遠(yuǎn)端正常組織中進(jìn)行實時熒光定量PCR驗證，分析miRNAs表達(dá)與食管癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，為今后進(jìn)一步研究食管癌發(fā)生的機(jī)制及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例標(biāo)本

收集2016—2018年新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的新疆哈薩克族食管癌組織及遠(yuǎn)端正常組織47對。組織病理切片均診斷為食管鱗狀上皮細(xì)胞癌，男性30例，女性17例。所有患者均具備完整的病理資料，并術(shù)前未接受放化療。所有標(biāo)本取材后迅速置于-80℃冰箱保存。按國際TNM手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)(UICC，2009年)：Ⅰ期1例，Ⅱ期17例，Ⅲ期29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例；低分化28例，高分化19例。

1.2 基因芯片與試劑

miRNA表達(dá)譜基因芯片為由北京博奧生物有限公司提供的Agilent基因芯片。Trizol試劑(Promega公司)，miScript II RT Kit，miScript SYBR Green PCR Kit，以及所有引物均購自北京天根生物有限公司。引物序列見表1。

1.3 miRNA表達(dá)譜基因芯片檢測及高通量篩選

將提取的組織總RNA進(jìn)行靶標(biāo)制備，芯片雜交，使用Agilent芯片掃描儀(G2565CA)對芯片進(jìn)行掃描，得到雜交圖片。應(yīng)用miRNA芯片分析系統(tǒng)(Agilent Feature Extraction v10.7，Agilent Gene Spring軟件)P-value方法對基因芯片雜交結(jié)果進(jìn)行分析。按如下標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)miRNA：log2|變化倍數(shù)|≥6為上調(diào)；log2|變化倍數(shù)|≤-2為下調(diào)。

表1 miRNA引物序列

1.4 熒光定量PCR反應(yīng)

采用Trizol試劑一步法提取組織總RNA，并用紫外分光光度計測定純度：RNA溶液D(260)/D(280)比值介于1.8～2.0之間為合格。按照miScript II RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，以提取的RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用得到的cDNA為模板進(jìn)行實時聚合酶鏈反應(yīng)。每個標(biāo)本都用U6做內(nèi)參照，反應(yīng)體積20μL，反應(yīng)條件：94℃、2 min；94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40個循環(huán)；72℃退火5 min。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 2-ΔΔCT相對定量法對實時聚合酶鏈反應(yīng)中基因表達(dá)的相對變化進(jìn)行分析，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包對miRNAs在癌組織和遠(yuǎn)端正常組織的相對表達(dá)量進(jìn)行t檢驗，不同臨床病理指標(biāo)分組中miRNAs相對表達(dá)量進(jìn)行t檢驗，miRNAs表達(dá)與食管癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行Spearsman雙變量相關(guān)性分析方法，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片篩選出差異表達(dá)的miRNAs

采用Agilent Gene Spring分析軟件(Agilent Feature Extraction v10.7)對新疆哈薩克族食管癌組織及癌旁組織原始芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩查出不同表達(dá)水平的miRNA(見圖1)。篩選出61個滿足條件的miRNAs，其中42個miRNA表達(dá)上調(diào)，19個miRNA表達(dá)下調(diào)(見表2)。

2.2 差異表達(dá)的miRNAs在哈薩克族食管癌組織及遠(yuǎn)端正常組織中表達(dá)分析

在47例食管癌組織中對miR-21、miR-132、miR-130b、miR-141、miR-143、miR-133b、miR-195、miR-140等8個消化道腫瘤相關(guān)的miRNA進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，實驗結(jié)果顯示：與遠(yuǎn)端正常組織相比，哈薩克族食管癌組織中miR-21、miR-132、miR-130b的表達(dá)水平顯著升高；miR-141、miR-143、miR-133b、miR-195表達(dá)水平顯著降低；miR-140表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義；實時熒光定量PCR檢測的 miR-21、miR-132、miR-130b、miR-141、miR-143、miR-133b、miR-195表達(dá)水平與Agilent miRNA基因芯片結(jié)果一致，熒光定量PCR檢測的miR-140表達(dá)水平與Agilent miRNA基因芯片結(jié)果不一致(見表3、圖2)。

圖1 microRNA表達(dá)譜分析

表2 差異表達(dá)的miRNAs

表3 miRNAs在47例哈薩克族食管癌組織及遠(yuǎn)端正常組織中表達(dá)

圖2 miRNAs在47例哈薩克族食管癌組織中表達(dá)

2.3 miRNAs表達(dá)與食管癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

中低分化的食管癌組織中miR-21、miR-141表達(dá)水平高于低分化組，miR-143、miR-133b的表達(dá)顯著低于高分化的腫瘤組織；隨著病程發(fā)展，與Ⅰ～Ⅱa相比，Ⅱb～Ⅲ分期中的miR-21、miR-132表達(dá)水平明顯上調(diào)，miR-143的表達(dá)水平顯著下調(diào)；在淋巴侵襲轉(zhuǎn)移的食管癌組織中miR-21、miR-132表達(dá)水平增高，而miR-143、miR-133b的表達(dá)水平明顯降低(見表4)。

表4 哈薩克族食管癌組織中miRNAs的相對表達(dá)水平與病理指標(biāo)的關(guān)系

3 討論

腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移是多基因表達(dá)失調(diào)及多因素共同作用的結(jié)果，大量研究證實[4]miRNAs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤初期雖然缺乏明顯的早期臨床表現(xiàn)，但可能相關(guān)的miRNAs表達(dá)水平卻已經(jīng)發(fā)生異常，根據(jù)miRNA功能大致可以分為抑癌性和致癌性miRNA兩類，他們分別原癌基因、抑癌基因相互作發(fā)揮效應(yīng)，所以探究腫瘤的發(fā)生發(fā)展與相關(guān)miRNAs之間的關(guān)系，尋找差異表達(dá)的miRNA，為進(jìn)一步深入研究其在腫瘤中的確切機(jī)制具有重要的意義。

miR-21、miR-132、miR-130b、miR-141、miR-143、miR-133b、miR-195、miR-140等8個miRNA是我們前期采用基因芯片篩查出的部分差異表達(dá)的miRNAs，熒光定量PCR檢測結(jié)果證實除miR-140在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)無統(tǒng)計學(xué)差異外，其余7個miRNAs在47例哈薩克族食管癌組織中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)和下調(diào)，檢測結(jié)果與基因芯片一致，提示哈薩克食管癌發(fā)生發(fā)展是多個miRNA表達(dá)失調(diào)共同作用的結(jié)果，miRNA表達(dá)異常通過調(diào)控相應(yīng)的原癌基因、抑癌基因及不同的信號傳導(dǎo)通路調(diào)控著腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移的過程。

在47例哈薩克族食管癌組織中miR-21、miR-132表達(dá)顯著升高，且在中低分化的腫瘤組織中miR-21表達(dá)明顯上調(diào)，提示在哈薩克族食管癌組織中miR-21高表達(dá)可能與細(xì)胞分化調(diào)控有關(guān)。在中晚期Ⅱb～Ⅲ臨床分期及有淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中miR-132明顯高表達(dá)，提示miR-132高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞生長侵襲有關(guān)。miR-21在正常組織中幾乎不表達(dá)或表達(dá)很低，在腫瘤中miR-21常見性的表達(dá)失控上調(diào)[5]，有研究證實通過多因素分析發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌患者的血漿miR-21水平高表達(dá)，上調(diào)食管癌細(xì)胞及肝癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與PI3K/Akt及ERK信號傳導(dǎo)通路有關(guān)[6-7]。本實驗中哈薩克族食管癌組織中miR-21高表達(dá)與以往研究結(jié)果相符，提示高表達(dá)的miR-21在哈薩克族食管癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮致癌基因的作用。目前研究證實miR-132的失調(diào)與前列腺癌、胃癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生緊密相關(guān)，Li等[8]研究表明在前列腺癌中miR-132高表達(dá)可導(dǎo)致p27、p21、E2F5下調(diào)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生。在胃癌患者及膠質(zhì)瘤患者血清中miR-132高表達(dá)，且可作為預(yù)測預(yù)后的獨(dú)立分子標(biāo)記物[9-10]。但也有文獻(xiàn)報道m(xù)iR-132在卵巢癌等腫瘤中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因的作用[11]。我們查閱了大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前miR-132在腫瘤中的表達(dá)及作用分子信號機(jī)制存在較大差異，可能與腫瘤類型不同miR-132發(fā)揮作用的機(jī)制不同，本實驗結(jié)果顯示在哈薩克族食管癌組織中miR-132高表達(dá)與臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，我們推測miR-132可能作為一個致癌性miRNA參與哈薩克族食管癌細(xì)胞的生長侵襲。

本實驗中miR-130b在哈薩克族食管癌組織中表達(dá)也顯著升高，提示miR-130b高表達(dá)參與了哈薩克族食管癌的發(fā)生發(fā)展過程，但在病理指標(biāo)分析中miR-130b高表達(dá)與細(xì)胞分化、臨床進(jìn)展分期及淋巴轉(zhuǎn)移均無顯著差異。有實驗表明在食管癌腫瘤組織和細(xì)胞中，高表達(dá)的miR-130b可以作為腫瘤啟動子促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤的生長，抑制miR-130b表達(dá)可顯著降低食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲性[12-13]。我們的實驗結(jié)果證實在哈薩克族食管癌發(fā)生發(fā)展過程中miR-130b表達(dá)失調(diào)，顯著上調(diào)，與以往的研究基本相符，但高表達(dá)的miR-130b與細(xì)胞分化、臨床進(jìn)展分期及淋巴轉(zhuǎn)移不相關(guān)，分析其可能原因一是是樣本量略小，不能夠全面反映出miR-130b與病理指標(biāo)的關(guān)系，另一原因可能是miR-130b的作用機(jī)制并不是直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡及轉(zhuǎn)移，而是作為一個調(diào)控分子，通過其他miRNA而發(fā)揮作用。

miR-141、miR-143、miR-133b等3個microRNA在47例哈薩克族食管癌組織中呈現(xiàn)出表達(dá)下調(diào)的趨勢，與癌旁組織相比差異顯著。在低分化的腫瘤組織中miR-141、miR-143、miR-133b的表達(dá)均顯著降低，且miR-143、miR-133b低表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示miR-141、miR-143、miR-133b表達(dá)失調(diào)參與了哈薩克族食管癌細(xì)胞分化增殖、侵襲轉(zhuǎn)移過程，miR-141、miR-143、miR-133b低表達(dá)更有利于腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲生長。有研究表明，miR-141在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的抑癌作用[14-15]，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的重要生物學(xué)過程，而miR-141可以通過激活靶基因ZEB1和SIP1(轉(zhuǎn)錄因子)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在腫瘤組織中miR-141低表達(dá)則意味著對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制作用喪失。Ni等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-143在食管鱗癌組織中表達(dá)顯著降低，并和腫瘤浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，體外細(xì)胞實驗中上調(diào)miR-143的表達(dá)可以顯著抑制食管癌細(xì)胞的生長及遷移和侵襲能力，miR-143在食管癌發(fā)生過程發(fā)揮抑癌基因的作用可能與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK-5有關(guān)。目前普遍認(rèn)為miR-133是人類許多惡性腫瘤的抑癌因子，熒光素酶報告試驗證實EGFR是miR-133b在食管鱗狀細(xì)胞癌的靶點(diǎn)，提示其調(diào)控機(jī)制可能與表皮生長因子受體EGFR有關(guān)，過表達(dá)miR-133b通過直接下調(diào)EGFR顯著降低PI3K、ERK和AKT的磷酸化從而抑制MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路激活，從而抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[18]。本實驗中miR-141、miR-143、miR-133b在哈薩克族食管癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與食管癌臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，組織分化相關(guān)，與以往研究結(jié)果基本相符，提示在哈薩克族食管癌組織中miR-141、miR-143、miR-133b表達(dá)失調(diào)，失去了對腫瘤細(xì)胞的正常抑制作用。

雖然miR-195在哈薩克食管癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，但其低表達(dá)在細(xì)胞分化、臨床進(jìn)展分期及淋巴轉(zhuǎn)移分組中并沒有顯著差異，提示雖然miR-195在哈薩克食管癌發(fā)生發(fā)展中表達(dá)失調(diào)，但其發(fā)揮作用的機(jī)制并不清楚。有研究表明，在肝癌患者清中miR-195的表達(dá)下調(diào)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，miR-195過表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[19]。本實驗結(jié)果與以往研究存在不同點(diǎn)，有待于擴(kuò)大樣本進(jìn)一步證實。

有研究顯示miR-140低表達(dá)與腫瘤分期或轉(zhuǎn)移有關(guān)，直腸癌中miR-140的表達(dá)明顯下降，過表達(dá)的miR-140可直接抑制直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[20]。本實驗中與遠(yuǎn)端正常組織相比，miR-140在哈薩克食管癌組織中的表達(dá)降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，47例腫瘤組織中的檢測結(jié)果與芯片結(jié)果不一致，可能與標(biāo)本例數(shù)不大有關(guān)，也有可能是芯片檢測存在一定的誤差，可擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)行深入探索。

綜上所述，除miR-140，其他7個miRNA在食管癌中的表達(dá)結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果一致，提示利用miRNA表達(dá)譜基因芯片可篩查出與食管癌發(fā)生有關(guān)的差異表達(dá)miRNAs。MiRNA與其靶基因以及一些相關(guān)的重要功能基因構(gòu)成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，miRNA表達(dá)失控可引起其調(diào)控的靶基因及相關(guān)信號通路激酶組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)生異常，從而促成腫瘤的發(fā)生及演進(jìn)，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。