熊 強(qiáng)，姜曉燕，丁立新，劉曉丹，周平坤，丁庫(kù)克，

(1．中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，北京 100088；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京市放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850)

【關(guān)鍵字】IER5；Sf9細(xì)胞；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)；鑒定

早期快速反應(yīng)基因5(immediate-early response gene 5，IER5)是早期慢反應(yīng)基因家族的一員，最早是由Williams等人發(fā)現(xiàn)并命名[1]。該基因位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)5帶3亞帶(1q25.3)，含2 350個(gè)核苷酸，無(wú)內(nèi)含子。IER5基因的開放閱讀框編碼327個(gè)氨基酸，和其他早期慢反應(yīng)基因家族pip92、IER2、ETR101一樣，氨基酸末端含豐富的脯氨酸，但與pip92、IER2、ETR101基因不同的是，IER5的轉(zhuǎn)錄激活不需要磷酸激酶C誘導(dǎo)[2]。

我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，輻射能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞IER5基因表達(dá)上調(diào)[3]；IER5基因的表達(dá)抑制可提高細(xì)胞分裂進(jìn)入G2/M期的比例，促進(jìn)細(xì)胞分裂，提高細(xì)胞對(duì)輻射的拮抗性，即IER5基因沉默使受輻射的宮頸癌與肝癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，參與了細(xì)胞周期調(diào)控[4]；IER5的表達(dá)顯著降低HeLa細(xì)胞電離輻射誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)效果[5]；輻射刺激下IER5抑制了CDC25B基因的表達(dá)，參與了對(duì)CDC25B基因的調(diào)控[6-7]。但我們尚未進(jìn)行IER5蛋白結(jié)構(gòu)方面的探索。

近年來(lái)，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由于具有安全性好、重組蛋白表達(dá)量高、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因、重組蛋白翻譯后加工完整等特點(diǎn)，因而受到廣泛應(yīng)用[8-9]。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)始于20世紀(jì)80年代，Smith等[10]人在昆蟲細(xì)胞中通過以桿狀病毒作為載體表達(dá)出了具有生物活性的人β干擾素。自此之后，經(jīng)過研究者們不斷地改進(jìn)優(yōu)化，昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體已經(jīng)有非常成熟的應(yīng)用。目前，市面上已經(jīng)有大量商品化的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，其中應(yīng)用較為廣泛是BD公司的BaeuloGold表達(dá)系統(tǒng)和Thermo公司的Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)。王浩等[11]比較了這兩種表達(dá)系統(tǒng)的效果，發(fā)現(xiàn)Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)效果更好。

本研究擬通過Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆和表達(dá)IER5蛋白，進(jìn)而為后續(xù)蛋白質(zhì)結(jié)晶和分析研究該蛋白的結(jié)構(gòu)，結(jié)合其結(jié)構(gòu)知識(shí)進(jìn)一步解釋在體內(nèi)的功能及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coli DH5α、質(zhì)粒中小提試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司，DH10Bac、草地夜貪蛾卵巢細(xì)胞Sf9、pFastBac1載體、Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑、sf-900Ⅱ SFM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher公司，桿狀病毒穿梭載體bacmid小量抽提試劑盒購(gòu)自Beyotime公司，限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、Hin dⅢ、Q5高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，瓊脂糖購(gòu)自BioFrox公司，DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物公司，IER5單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，所有引物均由北京中美泰和生物公司合成。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中IER5基因(Genbank登錄號(hào)：NC_000001.11，基因ID：51278)序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)帶有His標(biāo)簽引物，同時(shí)根據(jù)載體多克隆位點(diǎn)信息引入酶切位點(diǎn)(Eco RⅠ和Hin dⅢ)和相應(yīng)的保護(hù)堿基，引物序列為：上游引物5′-CCGGAA TTCGATGcatcatcaccatcaccatGAGTTCAAGCTGGAGGCT C-3′，下游引物 5′-CCCAAGCTTGTCAGAAGGCCAC GATGGCTGTGC-3′，下劃線表示酶切位點(diǎn)，小寫表示His標(biāo)簽序列。

1.3 IER5基因PCR擴(kuò)增

以HeLa細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50μL：5×Q5反應(yīng)緩沖液10μL，10 mol/L dNTPs 1μL，上下游引物各2.5μL，cDNA模板1 μL，5×Q5 High GC Enhancer 10 μL，Q5超保真DNA聚合酶，雙蒸水補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min；4℃保存。

1.4 重組轉(zhuǎn)移載體p FastBac1-IER5構(gòu)建及鑒定

用Eco RⅠ和Hin dⅢ酶分別對(duì)回收后的IER5基因目的片段和質(zhì)粒pFastBacTM1雙酶切。用T4 DNA連接酶連接雙酶切后的目的片段和質(zhì)粒片段，過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆菌落，繼續(xù)培養(yǎng)后用天根質(zhì)粒中小提試劑盒提取質(zhì)粒，并用Eco RⅠ和Hin dⅢ酶雙酶切鑒定。將雙酶切鑒定正確的菌株送公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組載體命名為pFastBac1-IER5。

1.5 重組穿梭載體rBacmid-IER5構(gòu)建及鑒定

將測(cè)序正確的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-IER5轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac，涂布于含50μg/mL卡那霉素(kanamycin)，7μg/mL慶大霉素，10μg/mL四環(huán)素，100μg/mL鹵代吲哚基-β-D-半乳糖苷和40μg/mL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48 h。從平板上挑取白色克隆菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒。利用PCR技術(shù)對(duì)重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，PCR引物為穿梭質(zhì)粒Bacmid的M13通用上下游引物(M13 正向引物：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAA CG-3′；M13反向引物：5′-AGCGGATAACAATTTCA CACAGG-3′)。PCR鑒定反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸3 min，共32個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確的重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒命名為rBacmid-IER5。

1.6 重組桿狀病毒的制備

參照Cellfectin Reagent轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，分別取3μg rBacmid-IER5重組質(zhì)粒和8μL轉(zhuǎn)染試劑于300 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中室溫孵育30 min后，將兩溶液混合室溫再孵育20 min。轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后5 h，將培養(yǎng)基換成含10%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集細(xì)胞及上清液，500 g離心5 min，去除細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片，收集上清，即為P1重組桿狀病毒。將P1代病毒感染Sf9細(xì)胞，48 h后，離心收集上清，即P2代重組桿狀病毒。

1.7 間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定重組桿狀病毒

將Sf9昆蟲細(xì)胞以8×105個(gè)/皿的量鋪于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，以MOI=1接種重組桿狀病毒，同時(shí)設(shè)立不接種病毒的Sf9細(xì)胞作為對(duì)照。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次后，用預(yù)冷的甲醇溶液固定細(xì)胞30 min。棄固定液，用PBS清洗3遍后用5%的封閉液室溫封閉1 h。棄封閉液，用PBS清洗3次后加入1∶400倍稀釋的兔源IER5單克隆抗體作為一抗，37℃孵育1 h。用PBS清洗3遍后，避光加入1∶500稀釋的FITC標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃孵育1 h。用PBS清洗3遍后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強(qiáng)弱并拍照。

1.8 重組蛋白SDS-PAGE和Western blot鑒定

將P2代病毒感染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集細(xì)胞及提取蛋白質(zhì)。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，用0.01%的考馬斯亮藍(lán)染液染色，脫色，成像分析結(jié)果。

電泳結(jié)束后將樣品轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(nitrocellulose)膜。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入1∶1 000稀釋的兔源抗IER5一抗，室溫放于低速搖床孵育2 h，用PBST清洗3遍。加入1∶2 000羊抗兔的二抗，室溫在搖床低速搖晃1 h，用PBST清洗3遍后加入化學(xué)發(fā)光液顯色。

2 結(jié)果

2.1 IER5基因擴(kuò)增

利用HeLa細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增IER5片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定結(jié)果如圖1所示，得到一條1 000 bp左右(1 022 bp)的條帶，與預(yù)期條帶大小一致。

圖1 IER5基因擴(kuò)增片段

2.2 雙酶切鑒定重組轉(zhuǎn)移載體p FastBac1-IER5

將經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切后的IER5片段和pFastBacTM1質(zhì)粒用T4DNA鏈接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶酶切，再用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結(jié)果如圖2所示，在1 000 bp和4 700 bp處有2條與預(yù)期大小一樣的條帶，與預(yù)期條帶大小一致，表明IER5基因已經(jīng)成功克隆入pFastBacTM1質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-IER5。

圖2 雙酶切鑒定重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-IER5

2.3 PCR鑒定重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-IER5

提取質(zhì)粒后，用穿梭質(zhì)粒Bacmid上的通用引物M13對(duì)重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3，在3 300 bp左右出現(xiàn)1條條帶，與預(yù)期大小一致，表明成功制備了重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-IER5。

2.4 轉(zhuǎn)染病毒后Sf9細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

Sf9細(xì)胞感染重組桿狀病毒后，每隔12 h觀察一次細(xì)胞的形態(tài)。如圖4B所示，大約到72 h左右，感染重組病毒后的細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯變化，細(xì)胞直徑慢慢增加，折光性變強(qiáng)，逐漸脫壁直至細(xì)胞破碎死亡。但圖4A所示的未感染重組病毒的細(xì)胞無(wú)明顯變化。

圖3 PCR鑒定重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-IER5

2.5 重組IER5蛋白間接免疫熒光

用P2代重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，用甲醛固定進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。如圖5B所示，在熒光顯微鏡下可以看到感染重組桿狀病毒的細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，而圖5A正常細(xì)胞未出現(xiàn)熒光，說(shuō)明重組IER5蛋白在昆蟲細(xì)胞中成功表達(dá)。

2.6 重組IER5蛋白SDS-PAGE和Western blot分析

為了鑒定重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量和活性，對(duì)重組蛋白進(jìn)行了SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)。SDSPAGE結(jié)果見圖6，泳道2顯示在48 k處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期條帶大小一致，而圖6泳道3顯示野生型桿狀病毒感染未出現(xiàn)特性條帶。

Western blot結(jié)果見圖7，泳道1顯示在48 k處出現(xiàn)特異性條帶，與SDS-PAGE結(jié)果一致，表明在Sf9細(xì)胞中表達(dá)的IER5重組蛋白能與抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖4 感染病毒后Sf9細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖5 間接免疫熒光檢測(cè)IER5重組蛋白的表達(dá)

3 討論

IER5為放療敏感基因，其過表達(dá)能抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出輻射增敏作用[12]。IER5蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白，主要存在于細(xì)胞核中。研究也發(fā)現(xiàn)，在輻射刺激下IER5下調(diào)了CDC25B基因的表達(dá)，且CDC25B基因是一種非常重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，所以IER5基因也與細(xì)胞周期密切相關(guān)[4，6-7]；日本的科學(xué)家也發(fā)現(xiàn)IER5基因的表達(dá)受熱休克因子1(heat shock factor 1，HSF1)調(diào)控的同時(shí)，也影響HSF1的去磷酸化，起到正調(diào)節(jié)的作用[12-15]。除此之外，該基因被發(fā)現(xiàn)參與DNA的損傷修復(fù)[5]。

圖6 SDS-PAGE檢測(cè)IER5蛋白表達(dá)

圖7 Western blot檢測(cè)IER5蛋白表達(dá)

桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲和昆蟲細(xì)胞為受體的真核表達(dá)系統(tǒng)[16]。本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IER5蛋白。首先我們將IER5基因克隆至轉(zhuǎn)移載體pFastBac1質(zhì)粒中，隨后把攜帶桿狀病毒基因組的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac，篩選轉(zhuǎn)座后的陽(yáng)性重組穿梭載體rBacmid-IER5，轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后獲得攜帶IER5基因的重組桿狀病毒顆粒，重復(fù)感染獲得P2代重組桿狀病毒，將P2代病毒感染昆蟲細(xì)胞，收獲IER5蛋白。結(jié)果表明，IER5蛋白在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。

本課題組前期嘗試用大腸桿菌原核系統(tǒng)表達(dá)IER5蛋白，但未成功表達(dá)。我們分析了IER5的基因序列，發(fā)現(xiàn)該基因的密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index，CAI)值為0.62，較低，不符合GenScript’s Optimum GeneTM密碼子優(yōu)化軟件所建議的高表達(dá)優(yōu)化CAI 0.8～1.0取值范圍[17]，故該基因不適合大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。隨后我們對(duì)IER5基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，仍然未在大腸桿菌中表達(dá)成功。我們又利用生物信息學(xué)對(duì)IER5蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定區(qū)較長(zhǎng)，表示該蛋白不穩(wěn)定。酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白水平高，但其表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌能力相對(duì)較低，且表達(dá)的蛋白質(zhì)糖基化修飾具有局限性[18]，所以我們選擇昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)IER5蛋白進(jìn)行表達(dá)。

本研究采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)IER5蛋白進(jìn)行表達(dá)，Western blot鑒定和間接免疫熒光結(jié)果顯示，昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白能夠被IER5特異性抗體識(shí)別，證明成功表達(dá)了重組IER5蛋白，且與預(yù)期大小相符，同時(shí)也說(shuō)明該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

本研究采用SDS-PAGE對(duì)重組蛋白進(jìn)行檢測(cè)，跟野生型桿狀病毒感染組相比，出現(xiàn)了特異性條帶，但是跟陽(yáng)性對(duì)照組(BSA)相比，目標(biāo)條帶較淺，說(shuō)明重組蛋白的表達(dá)量不高。分析原因，IER5蛋白主要存在細(xì)胞核中，可能與蛋白沒有胞外表達(dá)，以及細(xì)胞裂解后部分外源蛋白黏附在細(xì)胞碎片上有關(guān)[19]。為提高重組蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)水平，優(yōu)化后續(xù)試驗(yàn)的表達(dá)條件，進(jìn)一步探索蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)作準(zhǔn)備。