利用CRISPR - Cas9系統(tǒng)可以激活或抑制基因的表達(dá)。然而，在不使用外源性轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的情況下，目前仍然缺少能夠?qū)崿F(xiàn)劑量依賴性激活基因表達(dá)的工具。

美國北卡羅來納大學(xué)教堂山分校Nathaniel A. Hathaway、西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院Jian Jin等研究人員合作于2019年11月11日在Nature Biotechnology上發(fā)表了題為“Dose-dependent activation of gene expression is achieved using CRISPR and small molecules that recruit endogenous chromatin machinery”的有關(guān)CRISPR除基因編輯外其他生物學(xué)作用的相關(guān)論文。該研究發(fā)現(xiàn)利用CRISPR和小分子，通過招募內(nèi)源性染色質(zhì)機(jī)器可以實(shí)現(xiàn)劑量依賴性激活基因表達(dá)。

該報(bào)道，描述了化學(xué)表觀遺傳修飾器（CEMs），它通過招募內(nèi)源性染色質(zhì)激活機(jī)制的相關(guān)成分來激活目標(biāo)基因的表達(dá)，從而消除了對外源性轉(zhuǎn)錄激活蛋白的依賴。該系統(tǒng)由兩部分組成：含F(xiàn)K506結(jié)合蛋白（FKBP）的復(fù)合物中的催化失活的Cas9 （dCas9）以及一個含有FK506并連接一個能夠與細(xì)胞表觀機(jī)器相互作用的CEM。研究發(fā)現(xiàn)，CEMs上調(diào)目標(biāo)內(nèi)源性基因表達(dá)多達(dá)20倍或更多（這主要取決于目標(biāo)基因）。該研究還證明了轉(zhuǎn)錄激活的劑量依賴性調(diào)控，跨越多個不同基因的功能，CEM活性的可逆性以及整個基因組中同類最佳CEM的特異性。

作者首先介紹了CEMs，及其家族主要成員，以及說明了CEMs是如何調(diào)控靶基因的表達(dá)的（如圖1）。研究指出，該論文中CEM家族主要包括CEM87、CEM88和CEM114這三個成員，他們結(jié)合在染色體的不同區(qū)域。研究指出，CEMa家族與基于dcas9 - fkbp的系統(tǒng)兼容，允許我們將CEMa活性導(dǎo)向任何基因。

此外，該項(xiàng)研究還根據(jù)時(shí)間和劑量范圍對dCas9 - cema系統(tǒng)進(jìn)行評估，并根據(jù)當(dāng)前的dCas9激活技術(shù)對系統(tǒng)進(jìn)行基準(zhǔn)測試（如圖2）。為了靶向內(nèi)源基因，調(diào)整了優(yōu)化的dCas9–CEMa系統(tǒng)，以通過慢病毒感染dCas9機(jī)器（dCas9和MS2-FKBP）將其導(dǎo)入HEK293T細(xì)胞。為了確定觀察激活的最佳時(shí)間，研究者用gRNA轉(zhuǎn)染了表達(dá)dCas9和MS2-FKBP×2的細(xì)胞，并在處理后24、48、72、96和120 h進(jìn)行了RNA提取。 在處理后48小時(shí)，帶有MYOD1靶向gRNA的細(xì)胞在200 nM CEM87中表達(dá)顯著增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)靶向gRNA的細(xì)胞在50 - 400nm劑量范圍內(nèi)48h后，MYOD1呈劑量依賴性激活。然而，與未處理的細(xì)胞相比，NT gRNA的細(xì)胞在400 nM劑量處理48小時(shí)后，MYOD1的非特異性激活較低。

該研究還做了dCas9–CEMa系統(tǒng)的全基因組分析（如圖3）。為了研究通過將BRD4募集到MYOD1啟動子而引起的CEM激活的潛在脫靶或間接作用的程度，研究人員分析了整個轉(zhuǎn)錄組（通過RNA-seq）和全基因組BRD4結(jié)合譜（通過ChIP-seq）。 僅在CEM87和sgMYOD1均存在的情況下，才將BRD4募集到MYOD1的啟動子。BRD4在肌源性環(huán)境中對MYOD1具有強(qiáng)的正向調(diào)控作用，其中數(shù)千個MYOD的下游靶點(diǎn)被BRD4結(jié)合的順式調(diào)控元件激活，但在48h時(shí)，MYOD1是少數(shù)幾個獲得BRD4結(jié)合的位點(diǎn)之一。事實(shí)上，幾乎所有其他BRD4位點(diǎn)的結(jié)合都有所減少，這是小分子與BET溴域結(jié)合的已知效應(yīng)。在轉(zhuǎn)錄上，MYOD1被選擇性上調(diào)。

該研究合成并優(yōu)化了一類能夠以劑量依賴性，基因特異性方式激活內(nèi)源基因表達(dá)的CEMa分子。 通過使CEMa技術(shù)適應(yīng)dCas9靶向構(gòu)建體，幫助人們實(shí)現(xiàn)使用該系統(tǒng)通過戰(zhàn)略性gRNA設(shè)計(jì)從理論上靶向基因組中的任何基因。該研究已經(jīng)證明了以直接的，生物學(xué)上相關(guān)的方式控制染色質(zhì)景觀并誘導(dǎo)內(nèi)源性哺乳動物疾病相關(guān)基因表達(dá)變化的能力。這項(xiàng)dCas9–CEMa技術(shù)為靶向與疾病相關(guān)的基因提出的針對疾病作用機(jī)制的明確針對性問題鋪平了道路。由于該項(xiàng)研究的的基因激活平臺以劑量依賴性方式被化學(xué)激活，因此在靶標(biāo)驗(yàn)證工作中可用于在廣泛的靶標(biāo)基因濃度范圍內(nèi)可視化表型和基因劑量之間的趨勢的研究。