呂紫薇, 黃 凱, 甘文華, 高劭妍, 楊 波, 赫連凱玥, 李霄鶴△, 周紅剛△

(1南開大學藥物化學生物學國家重點實驗室， 南開大學藥學院和天津市分子藥物研究重點實驗室， 天津 300350；2天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院高通量分子篩選中心， 天津 300070； 3天津第一中心醫(yī)院胸外科， 天津 300192；4澳大利亞國立大學健康與醫(yī)學學院和理學院， 澳大利亞 堪培拉 2601)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種慢性進行性發(fā)展、致死性的、病因不明的間質(zhì)性肺疾病，患者確診后的平均生存期僅為 2.8 年，5 年生存率低于30%[1]。IPF的致病機理和治療靶點尚未研究透徹，治療手段匱乏，目前上市的治療藥物僅有吡非尼酮(pirfenidone,PFD)和尼達尼布(nintedanib,NDN)[2]。吡非尼酮的作用機制目前尚未完全闡明，已有的研究證實吡非尼酮具有抗炎、抗氧化和抗纖維化的廣泛作用。吡非尼酮批準用于IPF的治療主要是基于多項III期臨床試驗，其中具代表性的包括CAPACITY004試驗和ASCEND試驗。ASCEND研究結(jié)果顯示吡非尼酮治療組中IPF患者用力肺活量(forced vital capacity,FVC)下降率≥10%的發(fā)生率減少了47.9%[3]。尼達尼布是小分子酪氨酸激酶抑制劑，通過阻斷血小板源性生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)、成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor,FGFR)和血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor,VEGFR)等參與纖維化進程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制成纖維細胞增殖、活化和遷移，起到抗肺纖維化的作用[4]。尼達尼布在3個國際多中心Ⅱ/Ⅲ期臨床研究中一致性減少患者FVC年下降率達50%[5-6]。此外，與吡非尼酮和N-乙酰半胱氨酸相比，尼達尼布是唯一顯著降低急性加重風險的抗纖維化藥物[7]。故此，兩藥均可延緩疾病進展，改善患者生活質(zhì)量。但截至目前，并未有臨床或臨床前研究將吡非尼酮和尼達尼布在同一實驗體系中進行抗肺纖維化藥效比較。因此，本研究旨在比較吡非尼酮和尼達尼布在博來霉素(bleomycin,BLM)誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中的作用效果，為臨床選擇用藥提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與藥品

SPF級C57BL/6雄性小鼠120只，8～10周齡，體重20～25 g，購于北京軍事醫(yī)學科學院，飼養(yǎng)于南開大學動物實驗中心，許可證編號為SYXK(津)2014-0003。博來霉素(日本化藥株式會社)；吡非尼酮(大連美侖生物技術(shù)有限公司，濃度>98.5%)；尼達尼布(北京華威銳科化工有限公司，濃度為99%)，兩藥均溶于羧甲基纖維素鈉后制成混懸液。

2 模型制備與分組給藥

根據(jù)藥物的給藥時間及給藥時長，將博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型分為5類：炎癥期給藥模型、纖維化期預(yù)防給藥模型、纖維化早期治療模型、纖維化晚期治療模型、全程給藥模型。每類模型分別將24只小鼠隨機分為生理鹽水(NaCl)組、博來霉素(BLM)組、吡非尼酮組和尼達尼布組，每組6只。按照經(jīng)典的博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型造模方法[8-9]，具體實施方式如下：第0天時，麻醉小鼠后稱重記錄，將小鼠固定于操作臺，頸部用75%乙醇消毒，用手術(shù)刀在小鼠頸部垂直劃開大約1 cm長創(chuàng)口，利用顯微鑷分離組織暴露氣管，將注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，然后按2 mg/kg的劑量緩慢注入與其體重相適應(yīng)體積的博來霉素生理鹽水溶液，立即將動物直立并左右旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布?？瞻讓φ战M注射等量的生理鹽水。吡非尼酮和尼達尼布分別按200 mg/kg和100 mg/kg劑量灌胃給藥，對照組和博來霉素組給予等量生理鹽水。具體造模、給藥及取材時間如圖1所示，簡單描述為：(1)炎癥時期給藥模型：博來霉素造模后，第1～7天吡非尼酮和尼達尼布灌胃給藥，第8天麻醉小鼠后進行眼球取血，采集肺泡灌洗液和肺組織；(2)纖維化早期預(yù)防給藥模型：博來霉素造模后，第1～7天吡非尼酮和尼達尼布灌胃給藥，第14天麻醉小鼠后采集肺組織；(3)纖維化早期治療模型：博來霉素造模后，第7～13天吡非尼酮和尼達尼布灌胃給藥，第14天麻醉小鼠后采集肺組織；(4)纖維化晚期治療模型：博來霉素造模后，第14～20天吡非尼酮和尼達尼布灌胃給藥，第21天麻醉小鼠后采集肺組織。(5)全程給藥模型：博來霉素造模后，第1～20天吡非尼酮和尼達尼布灌胃給藥，第21天麻醉小鼠后采集肺組織。

Figure 1. The study settings and drug treatment protocols.n=6. Gavage: pirfenidone or nintedanib was given by intragastric administration. D: day.
圖1 動物模型造模及給藥示意圖

3 標本采集及保存

小鼠麻醉后進行眼球取血，離心并取上清，-20 ℃保存。全肺進行肺泡灌洗，灌洗液離心取上清凍存于-20 ℃，沉淀物用于涂片進行炎癥細胞計數(shù)。右肺凍存于-80℃，左肺用于HE染色。

4 主要觀察指標及方法

4.1早期肺泡灌洗液中炎癥細胞計數(shù)及白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-4、IL-6和干擾素γ(inter-feron γ,IFN-γ)濃度檢測 使用紅細胞裂解液處理肺泡灌洗液沉淀后，取適量體積涂于載玻片上進行HE染色，在光學顯微鏡進行巨噬細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞計數(shù)，總細胞計數(shù)使用Countstar全自動細胞計數(shù)儀。通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定炎癥期模型肺泡灌洗液上清中的IL-1β、IL-4、IL-6和IFN-γ濃度，試劑盒購于Invitrogen。

4.2肺組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量以及血清中髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)含量的測定 取適量右肺組織勻漿，離心，提取上清液，采用微量法試劑盒測定肺勻漿上清中的SOD活性和MDA含量，ELISA法測定血清中MPO的含量，試劑盒均購于北京索來寶科技有限公司。

4.3其它指標檢測 利用酸水解法測定右肺羥脯氨酸含量，左肺脫水、包埋、切片、進行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理，并使用Image Pro Plus軟件統(tǒng)計肺纖維化面積。

5 統(tǒng)計學處理

使用Graphpad prism 7.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。組間比較采用成組t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 抗炎抗氧化能力的比較

1.1抗炎實驗結(jié)果

1.1.1肺泡灌洗液中炎癥細胞計數(shù)檢測結(jié)果 炎癥時期給藥模型中， 經(jīng)吡非尼酮和尼達尼布處理后，肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)量及各類炎癥細胞數(shù)量均降低。與博來霉素組相比，尼達尼布給藥組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)顯著下降(P<0.01)，下降比率為81%；吡啡尼酮給藥組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)下降率為25%，與博來霉素組相比差異無統(tǒng)計學意義。尼達尼布組的巨噬細胞數(shù)量較博來霉素組顯著下降(P<0.01)；而博來霉素組與吡非尼酮組的巨噬細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學顯著性。與博來霉素相比，吡非尼酮和尼達尼布均顯著抑制小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞數(shù)量，對其抑制率分別為47%(P<0.01)和65%(P<0.01)。尼達尼布組淋巴細胞數(shù)量較博來霉素組顯著下降(P<0.05)；吡非尼酮組淋巴細胞數(shù)目較博來霉素組比較無顯著差異，見圖2。

Figure 2. The number of inflammatory cells in alveolar lavage fluid. Mean±SEM.n=6.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05,**P<0.01vsBLM group.
圖2 肺泡灌洗液中炎癥細胞數(shù)量比較

1.1.2肺泡灌洗液中炎癥因子與IFN-γ檢測結(jié)果 在炎癥期給藥模型中，與博來霉素組相比，吡非尼酮干預(yù)后，可顯著降低IL-1β含量和IL-4含量(P<0.01)，但IL-6含量和IFN-γ含量與博來霉素組無顯著差異。尼達尼布組IL-1β、IL-4和IL-6含量與博來霉素組相比顯著下降(P<0.05)。與正常組相比，博來霉素組IFN-γ含量顯著下降(P<0.01)，尼達尼布治療后IFN-γ顯著升高(P<0.05)。吡非尼酮組和尼達尼布組相比，吡非尼酮對IL-1β和IL-4的抑制效果顯著，抑制率分別為61%和65%，尼達尼布對IL-6和IFN-γ的作用顯著，對IL-6的抑制率約為74%，見圖3。

Figure 3. The concentrations of inflammatory factors and IFN-γ in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined by ELISA. Mean±SEM.n=6.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05,**P<0.01vsBLM group.
圖3 肺泡灌洗液中炎癥因子和IFN-γ含量比較

1.2抗氧化實驗結(jié)果 在炎癥時期給藥模型中，與正常組相比，博來霉素組小鼠肺組織勻漿中SOD活性顯著降低(P<0.01)，經(jīng)吡非尼酮和尼達尼布處理后，SOD活性顯著升高(P<0.01)。博來霉素組肺組織勻漿中MDA含量較正常組顯著升高(P<0.01)，且血清中MPO含量也較正常組顯著升高(P<0.01)，經(jīng)吡非尼酮處理后，MDA和MPO含量可顯著降低(P<0.05)；經(jīng)尼達尼布處理后，MDA和MPO含量也顯著降低(P<0.01)。兩藥相比，吡非尼酮對SOD活性的提升效果顯著，而尼達尼布對MDA和MPO含量的降低效果更為顯著，見圖4。

Figure 4. Comparison of SOD and MDA contents in lung homogenate and MPO contents in serum. Mean±SEM.n=6.##P<0.01vsNaCl group;*P< 0.05,**P< 0.01vsBLM group.
圖4 肺勻漿中SOD和MDA含量以及血清中MPO含量比較

2 纖維化各時期指標對比

2.1羥脯氨酸含量結(jié)果 吡非尼酮和尼達尼布均可降低造模后小鼠肺部羥脯氨酸含量。預(yù)防性給藥時，吡非尼酮對羥脯氨酸含量的降低效果較顯著(P<0.01)；早期、晚期及全程給藥時，尼達尼布對羥脯氨酸含量的降低效果較顯著(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. Hydroxyproline contents in right lung tissues from C57BL/6 mice after bleomycin treatment were measured in four pulmonary fibrosis models.A:early prevention study;B:early therapy study;C:late therapy study; D: full-course therapy study. Mean±SEM.n=6.#P<0.05,##P<0.05vsNaCl group;*P<0.05,**P<0.01vsBLM group.
圖5 右肺羥脯氨酸含量比較

2.2兩藥對肺組織病理學變化的影響 預(yù)防性給藥模型和早期治療模型的博來霉素組中，氣道壁明顯增厚，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，具有較明顯的肺泡炎，部分肺泡實變，纖維化形成，見圖6，使用Image Pro Plus軟件統(tǒng)計切片肺纖維化面積達18.97%，見圖7A、7B；晚期和全程博來霉素組中，肺泡隔增寬明顯，肺泡結(jié)構(gòu)大部分破壞，纖維結(jié)締組織增生明顯，形成較明顯的肺間質(zhì)纖維化，統(tǒng)計纖維化面積為27.35%，見圖7C、7D。吡非尼酮和尼達尼布處理后，肺纖維化病變減輕。預(yù)防給藥時吡非尼酮組纖維化面積較博來霉素組顯著降低(P<0.05)，早期、晚期和全程給藥時，尼達尼布組纖維化面積較博來霉素組顯著降低(P<0.05)，見圖7。

Figure 6. Hematoxylin-eosin (HE) staining of mouse lung sections showing interstitial fibrosis with the disordered alveolar structures and fiber foci at 14 and 21 days after injection of bleomycin. Representative images of the staining are shown. A: early prevention study; B: early therapy study; C: late therapy study; D: full-course therapy study. Higher magnification of fibrotic area from the corresponding boxes. Bar=100 μm.
圖6 小鼠肺組織病理學檢測結(jié)果

Figure 7. The fibrotic area of the lung sections is presented as a percentage. A: early prevention study; B: early therapy study; C: late therapy study; D: full-course therapy study. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsBLM group.
圖7 肺組織病理切片纖維化面積比例

討 論

目前，吡非尼酮抗肺纖維化的確切作用機制尚不清楚，已有的研究表明，吡非尼酮主要通過抑制關(guān)鍵促纖維化因子TGF-β1表達，進而抑制成纖維細胞增殖和活化，抑制膠原蛋白合成，降低細胞外基質(zhì)沉積[10]。此外，在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，吡非尼酮可以在翻譯水平抑制肺泡灌洗液細胞中PDGF的生成，發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)[11]。而尼達尼布除通過靶向抑制VEGFR家族、FGFR家族、PDGFR家族以及Src和Flt-3激酶介導(dǎo)的促纖維化途徑外，同樣也可降低博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中TGF-β1的水平，并可抑制IPF患者肺成纖維細胞中TGF-βⅡ型受體的酪氨酸磷酸化，抑制下游Smad3和p38MAPK促纖維化信號通路的活化[12]。本研究通過在同一實驗體系中評估吡非尼酮和尼達尼布的抗炎抗氧化和抗肺纖維化效果，從動物水平檢測二者發(fā)揮藥效的作用共性和區(qū)別，尋找潛在的區(qū)別標志物，為臨床選擇用藥提供一定的參考。

在炎癥期模型中，吡非尼酮和尼達尼布均能降低肺泡灌洗液中總細胞數(shù)量和炎癥細胞數(shù)量，其中尼達尼布降低炎癥細胞數(shù)量的能力優(yōu)于吡非尼酮，這可能與尼達尼布靶向抑制VEGFR有關(guān)。VEGFR1主要表達于巨噬細胞表面，該信號通路介導(dǎo)巨噬細胞的遷移，并且給小鼠注射VEGFR1中和抗體可以抑制炎癥反應(yīng)[13]。此外，有研究表明，在哮喘模型中VEGF是肺部炎癥有效的刺激物，可通過IL-13依賴性和非依賴性途徑促進小鼠肺部炎癥的產(chǎn)生[14]。因此，在博來霉素誘導(dǎo)的炎癥期模型中尼達尼布可能通過靶向VEGFR1緩解小鼠肺部炎癥。

在肺纖維化進展過程中各炎癥因子的高表達也可促進炎癥反應(yīng)和纖維化發(fā)生。有學者提出，肺泡灌洗液中Th1/Th2失衡在肺纖維化的發(fā)病過程中起重要作用，Th1細胞和Th2 細胞分泌多種細胞因子參與肺纖維化的形成[15]。IL-1β、IL-4和IL-6等Th2細胞因子在肺纖維化早期階段介導(dǎo)肺泡的炎癥損傷，從而促進成纖維細胞活化、增殖、膠原合成，導(dǎo)致基質(zhì)蛋白沉積和纖維組織生成[16-18]。IFN-γ屬于Th1細胞因子，可以抑制成纖維細胞的增殖和纖維組織的生成[19]，促進其表達已成為IPF的潛在治療方法。有研究表明，IFN-γ霧化吸入可降低IPF患者肺泡灌洗液中IL-6的水平[20]。因此，尼達尼布對細胞因子IL-6和IFN-γ作用效果優(yōu)于吡非尼酮，其中可能的機制是尼達尼布促進了IFN-γ的表達，進而通過上調(diào)IFN-γ進一步抑制IL-6的含量。而吡非尼酮對Th2型細胞因子IL-β和IL-4的作用效果優(yōu)于尼達尼布，顯示二者存在不同的炎癥調(diào)控機制。研究顯示，博來霉素誘導(dǎo)IL-1β的分泌依賴于NLRP3炎癥小體的活化，從而引發(fā)持續(xù)性肺部炎癥，進而導(dǎo)致肺纖維化[21]。而吡非尼酮可以阻斷急性肺損傷小鼠中NLRP3炎癥小體激活[22]，因此吡非尼酮在博來霉素誘導(dǎo)的炎癥模型中，可能通過抑制NLRP3炎癥小體通路下調(diào)IL-1β的分泌。

氧化/抗氧化失衡引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)也是IPF發(fā)病的重要機制之一[23-24]。其中，MDA含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度[25]。MPO主要由中性粒細胞分泌催化反應(yīng)生成過量的氧化物質(zhì)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和氧化性組織損傷[26]，尼達尼布在降低MPO含量過程中效果更顯著，可能與其顯著抑制中性粒細胞浸潤有關(guān)。SOD可清除氧自由基，保護細胞免受自由基的損傷。吡非尼酮顯著提高SOD活性，而尼達尼布顯著降低MDA和MPO含量，可能由于二者具有不同的抗氧化機制，但通過比較對抗氧化最終標志物——MDA、MPO的抑制效率，尼達尼布抗氧化能力優(yōu)于吡非尼酮。

在肺纖維化模型中，吡非尼酮和尼達尼布均能降低博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的羥脯氨酸含量。預(yù)防模型中，吡非尼酮效果更為顯著；早、晚期和全程給藥時，尼達尼布效果較顯著。病理切片結(jié)果顯示吡非尼酮和尼達尼布能夠明顯改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，使小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常化，顯著降低肺纖維化面積。在早、晚期和全程給藥時，尼達尼布對小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常化、降低肺纖維化面積的作用效果優(yōu)于吡非尼酮。

綜上所述，在炎癥期模型中，吡非尼酮和尼達尼布的抗炎抗氧化作用效果近似；在肺纖維化預(yù)防模型中，吡非尼酮作用效果優(yōu)于尼達尼布；在肺纖維化早期、晚期以及全程治療模型中，尼達尼布作用效果優(yōu)于吡非尼酮。雖然動物模型的各種階段不能和實際IPF患者所處階段一一對應(yīng)，但該動物實驗結(jié)果在一定程度上可與二者藥物說明書對應(yīng)：吡非尼酮說明書中提及可改善輕到中度特發(fā)性肺纖維化，但可能使重度特發(fā)性肺纖維化患者無法受益，尼達尼布能用于治療輕、中、重度特發(fā)性肺纖維化患者，并且是唯一顯著降低IPF患者急性加重發(fā)生風險的抗纖維化藥物；因此結(jié)合兩藥臨床數(shù)據(jù)實際情況，晚期IPF患者選擇服用尼達尼布可能比吡非尼酮更加受益。本研究在同一動物實驗體系中，通過對吡非尼酮和尼達尼布在抗炎、抗氧化和抗纖維化等方面進行檢測對比，希望可為臨床選擇用藥提供一定的參考。