付 蓓，賀惠娟

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)， 湖北 武漢 430065)

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，每年約有180萬人因肺癌死亡[1]。依照組織病理學(xué)分類，肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌[2]，其中非小細(xì)胞肺癌占大多數(shù)，約85%左右。非小細(xì)胞肺癌包括肺腺癌和肺鱗癌，有資料表明，肺腺癌發(fā)病率增長迅速[3]。外科手術(shù)是目前早期肺腺癌治療的首選方式，盡管如此，由于早期發(fā)病隱蔽，不易診斷，一旦發(fā)現(xiàn)已到中晚期并可能伴有轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其病死率高。因此，亟需深入研究肺腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找高敏感性和特異性的腫瘤標(biāo)志物，以期為早期診斷和防治及預(yù)后判斷提供更為可靠依據(jù)。高遷移率族蛋白B2(high-mobility group protein B2，HMGB2)是HMG蛋白家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)它與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4-5]。但目前HMGB2在肺腺癌中的作用尚無報道，本研究基于腫瘤網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫探究HMGB2在肺腺癌中的表達(dá)及其與細(xì)胞功能狀態(tài)和預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步探究其在肺腺癌發(fā)生中的可能作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 生物信息學(xué)資料分析

采用Cancer RNA-Seq Nexus (CRN)數(shù)據(jù)庫(http://syslab4.nchu.edu.tw)分析肺腺癌組織HMGB2表達(dá)情況；采用OncoLnc數(shù)據(jù)庫(http://www.oncolnc.org)分析HMGB2表達(dá)與肺腺癌或肺鱗癌預(yù)后的相關(guān)性；采用COX回歸法進(jìn)行高/低表達(dá)組生存分析，該數(shù)據(jù)庫肺癌資料均來源于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫；采用腫瘤單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/)分析HMGB2基因表達(dá)與癌細(xì)胞14種功能狀態(tài)的相關(guān)性，并進(jìn)一步分析HMGB2基因表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞功能狀態(tài)的相關(guān)性。

2 材料和儀器

人肺腺癌A549細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰酶和青鏈霉素雙抗購自Gibco；PrimeScriptTMRT reagent Kit和TB Green? Premix Ex TaqTM購自大連寶生物公司；CCK8檢測試劑盒購自上海東仁科技公司；HMGB2引物序列引物由上海生工生物工程公司合成；靶向HMGB2的siRNA和riboFECT CP Transfection Kit購自廣州銳博生物公司；抗HMGB2抗體購自Abcam。CO2培養(yǎng)箱為Thermo產(chǎn)品；熒光定量PCR儀為ABI產(chǎn)品；熒光顯微鏡為Olympus產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為BioTek產(chǎn)品；蛋白電泳分離、轉(zhuǎn)膜和成像系統(tǒng)為Bio-Rad產(chǎn)品。

3 方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，細(xì)胞生長至80%左右融合度時傳代，取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗研究。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞分為對照(control)組、NC-siRNA組和HMGB2-siRNA組，按照riboFECT CP Transfection Kit說明書步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，采用real-time PCR和Western blot檢測HMGB2水平來評價轉(zhuǎn)染效率。

3.2Real-time PCR和Western blot檢測A549細(xì)胞HMGB2的表達(dá) 將A549細(xì)胞按每孔5×105個接種于6孔板，依照不同分組進(jìn)行實驗處理，48 h后用TRIzol裂解液提取總RNA，操作按試劑說明書進(jìn)行，再用PrimeScriptTMRT reagent Kit將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。用TB Green? Premix Ex TaqTM進(jìn)行檢測，real-time PCR 程序為 95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT法對HMGB2 mRNA表達(dá)進(jìn)行相對定量分析[6]。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1. Primer sequences for real-time PCR

將A549細(xì)胞按每孔5×105個接種于6孔板，依照不同分組進(jìn)行實驗處理，48 h后用RIPA裂解液收集細(xì)胞總蛋白，BCA定量后煮沸蛋白變性。取30 μg總蛋白，10%的SDS-PAGE膠分離蛋白后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，脫脂奶粉封閉1 h后，HMGB2抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，II 抗(1 ∶5 000)室溫避光孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光后成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集及灰度分析。

3.3CCK8和EdU實驗檢測A549細(xì)胞增殖 將A549細(xì)胞按每孔5×103個接種于96孔板，依照不同分組進(jìn)行實驗處理，48 h后每孔加入10 μL的CCK8試劑，37 ℃孵育2 h后通過酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度(A)值。將A549細(xì)胞按每孔5×105個接種于6孔板，依照不同分組進(jìn)行實驗處理，48 h后每孔加入1 mL 50 μmol/L EdU培養(yǎng)基，37 ℃孵育2 h，PBS清洗后多聚甲醛固定，細(xì)胞破膜后Apollo染色和DAPI染核30 min，PBS清洗后熒光顯微鏡下觀察拍照。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖片繪制，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，其中兩兩比較選擇Bonferroni校正的t檢驗進(jìn)行，以P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺腺癌組織HMGB2基因表達(dá)

采用CRN數(shù)據(jù)庫分析肺腺癌組織HMGB2表達(dá)情況，結(jié)果顯示，肺腺癌組織中HMGB2表達(dá)較正常肺組織高，依照腫瘤分期不同，正常、ⅠA期、ⅠB期、ⅡA期、ⅡB期、ⅢA期、ⅢB期和Ⅳ期的HMGB2表達(dá)的TPM均數(shù)分別為41.67、70.96、89.24、90.35、94.54、80.26、93.94和107.0，見圖1。

Figure 1.HMGB2gene expression in lung adenocarcinoma tissues.
圖1 肺腺癌組織HMGB2基因表達(dá)

2 HMGB2基因表達(dá)與肺腺癌/肺鱗癌患者預(yù)后關(guān)系

利用OncoLnc數(shù)據(jù)庫分別分析HMGB2表達(dá)與肺腺癌或肺鱗癌預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，肺腺癌患者中，HMGB2高表達(dá)組患者總生存期明顯低于HMGB2低表達(dá)患者(log-rank檢驗P=0.0173)；而肺鱗癌患者中，HMGB2高表達(dá)組患者總生存期與HMGB2低表達(dá)患者無明顯差異(log-rank檢驗P=0.142)，見圖2。

3 HMGB2基因表達(dá)與癌細(xì)胞功能狀態(tài)的相關(guān)性

利用CancerSEA網(wǎng)站分析HMGB2與惡性腫瘤細(xì)胞14種功能狀態(tài)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，HMGB2表達(dá)與細(xì)胞多種功能狀態(tài)相關(guān)，其中與細(xì)胞周期和增殖呈正相關(guān)，見圖3。我們進(jìn)一步對于HMGB2與2項肺腺癌(LUAD)細(xì)胞功能狀態(tài)的相關(guān)性進(jìn)行分析，該肺腺癌數(shù)據(jù)來源于2個不同研究[Kim KT. Genome Biol. 2015；Guillaumet-Adkins A. Genome Biol. 2017]，癌細(xì)胞數(shù)量分別為126個和42個。結(jié)果顯示，HMGB2表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞周期和增殖呈正相關(guān)，2個肺腺癌數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)分別為0.825/0.740和0.673/0.643，見圖4。

Figure 2. Relationship betweenHMGB2gene expression and prognosis of the patients with lung adenocarcinoma (LUAD) and squamous-cell carcinoma (LUSC).
圖2HMGB2基因表達(dá)與肺腺癌/肺鱗癌患者預(yù)后關(guān)系

4 HMGB2-siRNA對人肺腺癌A549細(xì)胞的沉默效果

通過siRNA轉(zhuǎn)染敲減A549細(xì)胞HMGB2的表達(dá)，并驗證沉默效果，結(jié)果顯示，與對照組相比，NC-siRNA組HMGB2的mRNA和蛋白表達(dá)均無明顯差異(P>0.05)；而與NC-siRNA組相比，HMGB2-siRNA組HMGB2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖5。

5 HMGB2對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響

通過CCK8和EdU實驗檢測A549細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，NC-siRNA組的細(xì)胞活力和增殖能力無明顯差異(P>0.05)；而與NC-siRNA組相比，HMGB2-siRNA組的細(xì)胞活力和增殖能力顯著降低(P<0.05),見圖6。

討 論

肺腺癌是最常見的肺癌類型，約占肺癌的40%，其從小氣道上皮II型肺泡細(xì)胞轉(zhuǎn)化發(fā)展而來，能夠分泌黏液和其他物質(zhì)[7]。肺腺癌是一種惡性程度和致死率高的腫瘤類型，中晚期患者總生存率往往不超過5年。有鑒于此，亟需探究肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，有助于探尋早期肺腺癌防診治和預(yù)后的分子靶標(biāo)。

高遷移率族蛋白是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)蛋白質(zhì)，其家族成員包括HMGB1～4，在染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能及基因表達(dá)調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用[8]。其中HMGB1是研究最為廣泛的成員，其首先被發(fā)現(xiàn)作為晚期炎癥介質(zhì)在膿毒癥中發(fā)揮作用[9]。HMGB1在組織損傷后釋放并激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，與許多風(fēng)濕免疫性疾病密切相關(guān)[10]。研究報道HMGB1可以通過多種信號通路參與腫瘤的進(jìn)展，迄今為止，世界各地的不同研究團(tuán)隊已報道了HMGB1在肝、肺、乳腺、結(jié)腸直腸、前列腺、宮頸和卵巢腫瘤中發(fā)揮作用[11]。HMGB家族成員結(jié)構(gòu)上高度同源，鑒于此，HMGB2是否與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)也受到研究者的關(guān)注，有報道表明其與一些腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。Cui等[5]研究發(fā)現(xiàn)HMGB2能促進(jìn)胃癌的惡性程度及不良預(yù)后；石小康等[12]發(fā)現(xiàn)HMGB2高表達(dá)與肝癌患者臨床病理及預(yù)后顯著相關(guān)。但HMGB2在肺腺癌中的作用和具體機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

Figure 3. Correlation betweenHMGB2gene expression and functional status of cancer cells in different malignant tumor cells.
圖3 不同惡性腫瘤細(xì)胞HMGB2基因表達(dá)與癌細(xì)胞功能狀態(tài)的相關(guān)性

Figure 4. Correlation betweenHMGB2gene expression and functional status of cancer cells in lung adenocarcinoma cells.
圖4 肺腺癌細(xì)胞HMGB2基因表達(dá)與癌細(xì)胞功能狀態(tài)的相關(guān)性

Figure 5. The silencing effect of siRNA onHMGB2expression in human lung adenocarcinoma A549 cells. A: the results of real-time PCR; B: the images and the quantitatative analysis of Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC-siRNA group.
圖5 siRNA對人肺腺癌A549細(xì)胞HMGB2的沉默效果

Figure 6. Effect of HMGB2 on the proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells. A: the quantitatative analysis of CCK8 assay; B: the images and the quantitatative analysis of the EdU assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNC-siRNA group.
圖6 HMGB2對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響

本文通過腫瘤基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)HMGB2在肺腺癌中高表達(dá)，再利用最新的單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫顯示HMGB2基因表達(dá)與肺腺癌細(xì)胞周期和增殖呈密切的正相關(guān)關(guān)系，同時HMGB2高表達(dá)組患者總生存期明顯低于HMGB2低表達(dá)患者。提示HMGB2高表達(dá)可通過細(xì)胞周期調(diào)控增殖，參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。真核細(xì)胞通過調(diào)控細(xì)胞周期維持機(jī)體的正常代謝和增殖，細(xì)胞周期調(diào)控的改變能使得細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，異常增殖的腫瘤細(xì)胞是其發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)，因此，細(xì)胞周期和增殖相關(guān)調(diào)控信號機(jī)制成為抗腫瘤研究的熱點[13]。本研究進(jìn)一步在肺腺癌A549水平驗證了HMGB2對增殖的調(diào)控，利用siRNA沉默HMGB2表達(dá)后，A549細(xì)胞增殖能力減弱，提示HMGB2確實能參與肺腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控。劉愛蕙等[14]通過沉默HMGB2基因也發(fā)現(xiàn)可顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖；Kwon等[15]使用siRNA沉默肝癌細(xì)胞HMGB2后證實可以有效抑制細(xì)胞的增殖和克隆形成。這些證據(jù)和我們的研究結(jié)果一致，均表明HMGB2在肺腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖中起著關(guān)鍵作用。

本文利用腫瘤生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析了HMGB2在肺腺癌組織中高表達(dá)及與患者預(yù)后關(guān)系密切，發(fā)現(xiàn)HMGB2與肺腺癌細(xì)胞周期和增殖呈現(xiàn)正相關(guān)；進(jìn)一步在肺腺癌A549細(xì)胞水平上抑制HMGB2表達(dá)，證實其對細(xì)胞活力和增殖的調(diào)控。這提示HMGB2可以作為潛在的評估肺腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物和治療靶標(biāo)，為肺腺癌的防治提供新思路。